对乙酰氨基酚通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α信号通路影响HepaRG细胞线粒体新生

目的探讨对乙酰氨基酚(APAP)对HepaRG细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)信号通路介导的线粒体新生的影响。方法接种HepaRG细胞并给予生长培养基,待细胞长满后,替换为分化培养基进行诱导分化,每天观察细胞形态并拍照。APAP(0.125,0.25,0.5,1,2,4,8和12 mmol·L^(-1))处理诱导分化后的HepaRG细胞24和48 h,MTT法测定细胞存活率。Western蛋白印迹法检测细胞线粒体新生相关蛋白PGC-1α、核呼吸因子2(NRF-2)和线粒体转录因子A(TFAM),以及线粒体构成蛋白NADH脱氢酶亚基1(ND-1)的表达。结果诱导分化后显微镜下可见肝细胞样和胆管细胞样2种形态的细胞。与正常对照组相比,APAP作用24和48 h后,随APAP浓度的增加,细胞存活率不断降低,其IC_(50)分别5.64和2.65 mmol·L^(-1)。与正常对照组相比,APAP作用24 h,0.5,1,2和4 mmol·L^(-1)组PGC-1α表达水平显著增加(P<0.01),8 mmol·L^(-1)组显著降低(P<0.01);0.5 mmol·L^(-1)组NRF-2表达水平显著增加(P<0.05),2,4和8 mmol·L^(-1)组显著降低(P<0.01);1 mmol·L^(-1)组TFAM表达水平显著增加(P<0.05),4和8 mmol·L^(-1)组显著降低(P<0.01);0.5,1,2和4 mmol·L^(-1)组ND-1表达水平显著增加(P<0.01),8 mmol·L^(-1)组显著降低(P<0.01)。结论 APAP可诱导或抑制HepaRG细胞的线粒体新生,其机制可能与PGC-1α通路蛋白表达有关。

苦参碱致HepaRG细胞毒性研究

目的研究苦参碱对HepaRG细胞增殖、周期及凋亡的影响并初探其机制。方法采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测不同浓度(0. 5,1,2,4 mg/mL)苦参碱对HepaRG细胞活力的影响;检测苦参碱给药后,HepaRG细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色观察HepaRG细胞形态学变化;利用流式细胞仪检测苦参碱对HepaRG细胞内活性氧和线粒体膜电位变化;利用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡变化;利用PI/RNase检测细胞周期变化。结果 MTT和LDH结果显示苦参碱能明显抑制HepaRG细胞活力,并呈时间与剂量依赖关系; DAPI染色发现随着药物浓度升高,细胞形态发生明显变化,出现核固缩,呈亮蓝色,形成凋亡小体等。流式结果表明苦参碱能使HepaRG细胞内活性氧升高,线粒体膜电位水平下降;与对照组相比,给药组HepaRG细胞出现明显的凋亡细胞,且细胞凋亡率随苦参碱浓度增大而逐渐升高;给药组HepaRG细胞处于G0/G1期的细胞数减少,S期的细胞增多,表明苦参碱能将HepaRG细胞的细胞周期阻滞在S期。结论苦参碱在体外对HepaRG细胞有明显的细胞毒性作用,其机制可能是通过增加活性氧,使线粒体功能受损,改变细胞周期分布,诱导细胞凋亡。

柚皮苷和柚皮素对HepaRG细胞核受体蛋白表达的影响

目的考察柚皮苷和柚皮素对人肝癌细胞HepaRG中芳香烃受体(AhR)、孕烷X受体(PXR)、组成型雄甾烷受体(CAR)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)蛋白表达的影响。方法HepaRG细胞分为空白组、溶剂组(0.1%DMSO)、柚皮苷处理组(10、30、100μmol·L^-1)、柚皮素处理组(10、30、100μmol·L^-1)及利福平组(50μmol·L^-1),以相应药物处理24 h或48 h,免疫印迹法检测蛋白表达的变化。结果与空白组相比,100μmol·L^-1柚皮素干预HepaRG细胞24 h或48 h后都能显著下调芳香烃受体、孕烷X受体蛋白表达(P<0.01),对组成型雄甾烷受体、过氧化物酶体增殖物激活受体α蛋白表达没有显著性影响(P>0.05);10、30、100μmol·L^-1柚皮苷和10、30μmol·L^-1柚皮素干预HepaRG细胞24 h或48 h后,芳香烃受体、孕烷X受体、组成型雄甾烷受体和过氧化物酶体增殖物激活受体α蛋白表达均无显著变化(P>0.05)。结论100μmol·L^-1柚皮素能显著下调HepaRG细胞芳香烃受体、孕烷X受体的蛋白表达。

HepaRG细胞在药物代谢相关研究中的应用进展

HepaRG细胞在二甲亚砜存在下可分化为肝样细胞和胆管样细胞,分化阶段表达肝特异性功能包括CYP酶、转运蛋白及核受体,是替代原代人肝细胞研究体外药物代谢的合适模型,对药物开发及预测临床药物相互作用具有重要的意义。目前HepaRG细胞主要用于药物代谢机制、药物相互作用、药物肝毒性、细胞毒性和遗传毒性研究等。该文综述了近年来HepaRG细胞在药物代谢相关研究中的应用。

不同基底硬度在调控HepaRG细胞分化为肝细胞样细胞中的作用

目的:探讨基底硬度在调控肝祖细胞系Hepa RG细胞分化为肝细胞样细胞的可能性,为生物人工肝提供肝细胞来源。方法:实验分为4组,分别采用白蛋白-绿色荧光蛋白-报告系统、Image J软件检测细胞ALB的表达;倒置显微镜观察细胞形态;Alamar blue检测细胞数量。结果:在第4小时,4s组细胞的ALB分别与8s组、16s组、Glass组比较,差异无统计学意义(t=0.791,1.389,2.481,P>0.05);在第4天,4s组分别与16s组和Glass组比较,差异均有统计学意义(t=12.410,12.520,P<0.05),4s组与8s组比较,差异没有统计学意义(t=2.603,P>0.05);在第7天,4s组分别和8s组、16s组、Glass组比较,差异均有统计学意义(t=3.266,6.725,8.005,P<0.05)。显微镜观察结果显示Hepa RG细胞在分化前呈单一肝祖细胞样形态,分化后呈现肝细胞样和胆管细胞样形态。Alamar blue检测结果显示在第4和7天,4s组的细胞总数分别与8s组、16s组、Glass组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:软的基底更有利于HepaRG细胞分化。

应用优化高胆红素HepaRG细胞模型筛选茵栀黄含药血清中的潜在药效物质

本研究建立了一种优化的高胆红素细胞模型,以模拟人体黄疸病理状态,并进行细胞水平的茵栀黄药效物质筛选。用胆红素及丙磺舒共同孵育HepaRG细胞建立细胞模型;收集给予茵栀黄注射液后大鼠含药血清,测定经此含药血清干预后细胞内总胆红素、间接胆红素及细胞外直接胆红素含量;应用LC-MS/MS的动态多反应监测技术测定茵栀黄注射液中的复杂药物成分,并检测含药血清孵育后与HepaRG细胞结合(或进入细胞内)的药物组分。本研究动物实验遵守兰州大学第一医院伦理委员会规程。结果显示,经40μg·mL^(-1)胆红素及50μg·mL^(-1)丙磺舒共同孵育可建立48 h内稳定的高胆红素HepaRG细胞模型;本研究证实,茵栀黄注射液孵育高胆红素细胞模型后,细胞内总胆红素及间接胆红素含量可分别降低52.4%及60.1%,而细胞外直接胆红素含量可升高52.5%。DMRM模式可对53种药物成分进行测定,经含药血清孵育HepaRG细胞系后可从中筛选出8种潜在药效物质。本研究发现茵栀黄注射液在高胆红素细胞模型中具有显著退黄作用,应用本方法可成功筛选出茵栀黄注射液进入靶细胞内发挥作用的潜在药效物质。该方法简单、高效、灵敏、特异,可为中药药效物质的高通量筛选提供一种新的研究思路。

茜草对苍耳子诱导的HepaRG细胞毒性的保护作用

目的:研究茜草对苍耳子诱导的人肝细胞系HepaRG的细胞毒性是否产生某种影响。方法:采用MTT法研究苍耳子提取物的HepaRG细胞毒性,并考察加入茜草提取物后对细胞增殖率的影响;采用ALT和AST测试盒和活性氧(ROS)检测试剂盒,分别研究茜草提取物对苍耳子提取物诱导的HepaRG细胞毒性的生化指标变化。结果:苍耳子提取物对HepaRG细胞有一定的毒性作用,其半数抑制浓度约为60 g·mL^(-1),当加入茜草提取物对细胞增殖率有一定的提高作用;茜草提取物对HepaRG细胞中异常升高的ALT、AST和ROS水平有一定的逆转作用,且存在剂量-效应关系。结论:茜草对苍耳子所致肝细胞毒性有一定的保护作用。

入胞抑制剂Myrcludex-B合成肽对HBV感染HepaRG细胞体外感染模型的抑制作用研究

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞(HepaRG)的实验模型,并探索入胞抑制剂Myrcludex-B在体外感染模型中对HBV的抑制作用。方法将诱导成熟的HepaRG细胞分成加聚乙二醇(PEG)的感染组和无PEG的感染组,再将两种感染组分别分为添加Myrcludex-B肽段的处理组和不添加Myrcludex-B肽段的对照组,用HBV DNA阳性患者的血清对细胞进行感染。取细胞上清液,用荧光定量PCR检测上清液中HBV DNA的表达量,用化学荧光法检测细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量。两组间计量资料不服从正态分布的采用秩和检验,服从正态分布的采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果在处理组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为(103877.00±49013.24)拷贝/ml、(5050.09±631.26)拷贝/ml;在对照组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为(116188.57±50957.19)拷贝/ml、(5119.34±1102.43)拷贝/ml,两组中加PEG感染组的病毒滴度显著高于不加PEG感染组(P<0.05),差异有统计学意义。在加PEG的感染组中,加肽段处理组和无肽段对照组的病毒滴度分别为(103877.34±49013.24)拷贝/ml、(116188.57±50957.19)拷贝/ml,加肽段处理组病毒滴度明显下降(P<0.05),差异有统计学意义;该组0、1、2、3 d上清液中HBsAg的含量均为阳性,且0 d上清液中加肽段处理组的HBsAg较无肽段对照组呈明显下降趋势。结论用添加PEG的HBV DNA阳性血清体外感染HepaRG细胞的实验模型是可行的,且在该试验模型中,入胞抑制剂Myrcludex-B对HBV感染存在一定的抑制作用。

HepaRG和HepG2细胞聚球体的生长形态、细胞色素P450酶和白蛋白表达及对药物肝毒性敏感性的比较

目的对比研究人肝祖细胞HepaRG和人肝癌HepG2细胞体外3D聚球体在生长形态、功能蛋白表达和在药物肝毒性检测中敏感性的差异,为体外药物肝毒性检测模型的选择提供实验依据。方法以每孔100个细胞的密度分别将HepaRG和HepG2细胞接种于低吸附96孔板,构建体外3D肝细胞聚球体。于接种后第3,7,14和21天镜下观察各聚球体的形态,拍照并测定其平均直径;采用实时荧光PCR、免疫荧光染色和Western蛋白印迹法检测2种细胞聚球体中6种细胞色素P450(CYP450)酶和白蛋白mRNA和蛋白表达水平;分别用硫胺素、非阿尿苷、对乙酰氨基酚、苯溴马隆、环磷酰胺、异烟肼和奈法唑酮在2种细胞聚球体上单次或重复给药,采用CCK8法检测细胞存活率,并计算药物半数抑制浓度(IC_(50))。结果 HepaRG与HepG2细胞聚球体的体积随培养时间延长而增大,接种后第7,14和21天,HepaRG细胞聚球体平均直径分别为317.5,334.3和397.8μm,均小于同期HepG2细胞聚球体(P<0.01);实时荧光PCR结果显示,接种后第7和14天,HepaRG细胞聚球体CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4和白蛋白mRNA表达水平分别上调261.7,55.7,277.1,9.9,44.3,280.7和3.9倍,均高于同期HepG2细胞聚球体(P<0.01);免疫荧光染色和Western蛋白印迹法结果显示,接种后第10天,HepaRG细胞聚球体中CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4和白蛋白的蛋白表达水平分别为同期HepG2细胞聚球体的2.1,1.6,1.9,1.6,1.6,2.2和1.9倍(P<0.05,P<0.01)。重复给药,非阿尿苷、对乙酰氨基酚、苯溴马隆、环磷酰胺、异烟肼和奈法唑酮抑制HepaRG细胞聚球体细胞存活的IC_(50)分别为3.35,2.42,0.37,7.51,3.92和1.11 mmol·L^(-1),对Hep G2细胞聚球体的IC_(50)分别为36.49,>40,0.87,>20,35.74和2.57 mmol·L^(-1);单次给药,上述6种药物对2种细胞聚球体细胞存活的IC_(50)均>重复给药IC_(50),同样对HepRG细胞聚球体的IC_(50)<对HepG2的IC_(50)。结论与HepG2细胞聚球体比较,HepaRG细胞聚球体体积更小,形态保持更加稳定,CYP450酶和白蛋白表达水平更高,对药物肝毒性敏感性更高,是更为理想的药物体外肝毒性检测模型。

利用bcl-2抗Fas凋亡特性联合Fas抗体促进人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖

目的移植bcl-2转基因HepaRG细胞到小鼠体内,并联合使用Jo2抗体诱导鼠肝细胞凋亡策略,促进人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖。方法SCID鼠经脾移植2×106bcl-2转基因HepaRG细胞,移植后1d始腹腔注射0.2mg/kgJo2抗体,每周1次,持续10周为实验组;移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,同样给予Jo2抗体腹腔注射为对照1组,移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,未腹腔注射Jo2抗体为对照2组,建立人鼠嵌合肝动物模型。从2周开始,后4、8、12、16、20、24周,分别采用免疫组化、免疫荧光和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时相点实验组和对照组嵌合肝中肝组织人清蛋白以及人清蛋白mRNA,并用酶联免疫法(ELISA)定量检测鼠血清人清蛋白的含量。结果实验组和对照组小鼠均能存活至24周,鼠肝组织和血清中均能检测到清蛋白的表达。实验组肝组织和血清人清蛋白的表达均可持续到24周,人血清清蛋白高峰值为95.32ng/mL,出现在16周;而对照1组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到20周,人血清清蛋白高峰值为42.37ng/mL,出现在12周;对照2组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到12周,人血清清蛋白高峰值为22.91ng/mL,出现在8周。结论利用bcl-2抗Fas凋亡特性,转染bcl-2基因的HepaRG细胞移植并联合小剂量Jo2抗体腹腔注射SCID鼠,有利于人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖和存活。

三维胶原HepaRG微球的建立及其体外功能特征

背景:近年来的一些研究显示,HepaRG细胞三维培养模型可较好地模仿体内微环境,与二维培养相比显示出更好的肝分化和功能情况。目的:选择HepaRG人源肝祖细胞制备三维胶原微球,评价胶原微球内细胞适应性培养和功能表达情况。方法:以胶原蛋白作为基质材料,选择HepaRG和HepG2细胞分别建立三维胶原细胞微球模型,形成稳定的细胞球体,以HepaRG普通微球、HepG2普通微球、HepaRG二维培养、HepG2细胞二维培养为对照。培养1,6,12 d后,死活染色法观察细胞存活情况;培养1,6,12,16d后,检测各组上清尿素合成与CYP3A4分泌量;培养12d后,采用qPCR检测CYP3A4、CYP1A2、UGT1A1、CPS1mRNA相对表达,Western Blot检测肝细胞标志物白蛋白和CYP3A4蛋白表达水平。结果与结论:①连续培养12 d的活死染色显示,三维胶原微球内的活细胞数量较多,死细胞较少,具有较高的细胞活率,并且Hepa RG三维胶原微球内的细胞呈现出多个细胞簇紧密连接的交联结构;②Hepa RG三维胶原微球培养1,6,12 d后的尿素含量高于Hepa RG二维培养(P<0.05),Hep G2三维胶原微球培养1,6,12,16 d后的尿素含量高于Hep G2二维培养(P<0.05),Hepa RG三维胶原微球培养1,6,12 d后的CYP3A4分泌量高于Hepa RG二维培养(P<0.05),Hep G2三维胶原微球培养6,12 d后的CYP3A4分泌量高于Hep G2二维培养(P<0.05);③Hepa RG三维胶原微球内的CYP3A4、CYP1A2、UGT1A1和CPS1 mRNA相对表达高于Hepa RG二维细胞(P<0.05),Hep G2三维胶原微球内的CYP1A2相对表达高于Hep G2二维培养(P<0.05);④Hepa RG三维胶原微球内的白蛋白、CYP3A4蛋白表达水平高于Hep G2三维胶原微球、普通微球、二维培养(P<0.05);⑤结果表明,Hepa RG三维胶原微球具有高表达的肝功能水平,可为体外药物代谢评价、组织工程等应用提供研究参考。

基于三重四级杆质谱仪的一种定向细胞结合的植物化学组分筛选策略:发现中药制剂消癌平注射液中的潜在生物活性成分

消癌平注射液(XAP-Ⅰ)提取自通关藤,在我国临床上广泛用于治疗各种癌症,而从其复杂组分中阐释生物活性成分一直是学界研究的热点内容。本文结合三重四级杆质谱仪中的全扫描(full scan,FS)、母离子扫描(precursor ion scan,PCIS)、子离子扫描(product ion,PDIS)及多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式鉴定了XAP-Ⅰ中的主要孕甾烷糖苷及酚酸类成分,可利用丰富的加合离子信息确定组分结构特性并实现高灵敏度分析。此外,本文应用定向细胞结合植物化学组分筛选策略以发现XAP-Ⅰ中的生物活性成分,该策略可实现对XAP-Ⅰ的高通量定性、定量分析,并显著提高XAP-Ⅰ潜在生物活性成分筛选的灵敏度及选择性。

基于HepaRG活细胞的N-乙酰基转移酶1活性测定方法的建立与评价

目的建立基于人类肝癌HepaRG活细胞的N-乙酰基转移酶1(NAT1)活性测定方法,并对其测定结果进行评价。方法 HepaRG细胞用含10%牛血清和青、链霉素培养液进行培养。用免疫印迹技术考察培养24,48和72 h的HepaRG细胞中NAT1表达情况;用噻唑蓝实验测定NAT1底物4-氨基水杨酸(4-ASA)孵育24和48 h对细胞活力的影响,分别用液-质联用技术及免疫印迹技术考察不同浓度4-ASA对HepaRG细胞中NAT1活性及蛋白表达的影响,比较基于HepaRG活细胞的NAT1活性测定方法与传统组织/细胞裂解法对NAT1活性测定结果的影响。结果与培养24 h的HepaRG细胞相比(0. 71±4. 00×10^(-3)),培养48和72 h的HepaRG细胞中NAT1的表达量显著增加,分别为(0. 80±7. 00×10^(-3))和(1. 04±0. 04),差异均有统计学意义(均P <0. 05)。与对照组相比,浓度为5～100μmol·L^(-1)的4-ASA孵育HepaRG细胞24和48 h,对其活力无明显影响(均P> 0. 05); 25～100μmol·L^(-1)的4-ASA孵育HepaRG细胞8 h,对NAT1蛋白表达无明显影响(均P> 0. 05),且50～75μmol·L^(-1)的4-ASA孵育HepaRG细胞,培养液中4-ASA代谢物的生成量与底物浓度成正比。NAT1活性测定结果显示,HepaRG活细胞法测得的结果略低于传统的组织/细胞裂解法所测得的结果(P <0. 05或P <0. 01),但两者的酶促反应趋势比较相似。结论以4-ASA为反应底物建立的基于HepaRG活细胞的NAT1活性测定方法具有操作简单、结果稳定、可动态检测等优势,有望用于NAT1活性的动态测定及NAT1特异性抑制的高通量筛选。

人源HepaRG肝细胞毒性与遗传毒性高通量筛选方法的初步建立

目的利用正常人源肝细胞(HepaRG)和高内涵技术检测肝毒性标志物,并结合微核试验和单细胞凝胶电泳试验建立体外细胞毒性和遗传毒性的快速筛选平台。方法选取适当的荧光探针Hoechst33342、DCFH-DA、Fluo4-AM、Mito Tracker?Red CMX Ros联合高内涵技术研究不同大黄蒽醌类单体(AQs)对HepaRG细胞活性氧簇(ROS)、胞内Ca2+含量及线粒体膜完整性等肝毒性标志物的影响,并开展高内涵法胞质分裂阻断法微核试验和高通量彗星电泳试验,综合评价AQs致肝细胞毒性及染色体、DNA损伤情况。结果与对照组比较,HepaRG细胞经25.0μg/m L大黄素、12.5和25.0μg/m L芦荟大黄素、50和25.0μg/m L大黄酚处理24 h后,胞内ROS含量显著增多;12.5和25.0μg/m L芦荟大黄素和50.0μg/m L大黄酸可引起胞内Ca2+含量显著增多;大黄素25.0μg/m L、芦荟大黄素25.0μg/m L、大黄酚50.0和25.0μg/m L、大黄酸50.0和25.0μg/m L组导致线粒体明显损伤(P<0.05、0.01)。与对照组比较,25.0μg/m L大黄素诱导微核率、尾DNA含量和彗星尾距(OTM)数值均显著升高(P<0.05、0.01);50.0μg/m L大黄酚给药72 h后微核率显著升高(P<0.01)。结论 AQs的研究结果与现有文献报道基本相符。本研究成功建立肝细胞毒性和遗传毒性的联合快速筛选模型,有助于药物研发早期的毒性筛选。

大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的体内外遗传毒性评价

目的:评价大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(EG)的体内外遗传毒性,并比较体外细胞试验及大鼠体内实验评价结果的差异。方法:采用体外二维(2D)、三维(3D)细胞培养法分别构建2D、3D HepaRG细胞模型,造模成功后,分别将2D、3D HepaRG细胞分为空白对照组[0.5%二甲基亚砜(DMSO)]、丝裂霉素C组(阳性对照,0.1μg/mL)和EG低、中、高剂量组(10、50、200μg/mL),然后检测各组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量。将SD大鼠分为空白对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)、甲磺酸乙酯组(阳性对照,200 mg/kg)和EG低、中、高剂量组(100、300、1 000 mg/kg),每组6只,连续灌胃给药15 d,每天1次;15 d后检测各组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率及外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距。结果:在体外2D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01),EG各剂量组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量差异无统计学意义(P>0.05);在3D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01或P<0.001),EG高剂量组HepaRG细胞的尾DNA百分含量显著升高(P<0.01)。在大鼠体内实验中,与空白对照组比较,甲磺酸乙酯组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距均显著升高(P<0.01),EG高剂量组大鼠外周血淋巴细胞尾DNA百分含量显著升高(P<0.01),EG各剂量组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和肝细胞尾DNA百分含量、尾距差异无统计学意义(P>0.05),但随剂量增加有升高趋势。结论:本研究结果提示在2D细胞模型中,EG未导致染色体断裂及DNA损伤,但3D细胞模型长期给药和体内重复给药结果均显示EG存在一定DNA损伤风险,故3D HepaRG细胞模型的评价结果更接近大鼠体内实验结果。

3D HepaRG聚球体模型的建立

目的:构建用于体外肝毒性预测的药物安全性评价模型。方法:对比HepG2和HepaRG研究出更合适的细胞构建2D及3D聚球体模型。通过RT-PCR及免疫荧光检测等技术研究2种模型基因及蛋白表达的差异;采用阴性药物阿司匹林(aspirin,ASP)和叶酸(folic acid,FA)以及报道的具有显著肝毒性的阳性药物对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)、曲格列酮(troglizone,Tro)、奈法唑酮(nefazodone,Nef)、托卡朋(tolcapone,Tol)、异烟肼(isoniazid,Iso),通过CCK8实验及IC50值对比其优势。结果:HepaRG显著优于HepG2,其3D聚球体模型中Ⅰ/Ⅱ相药物代谢酶、转运体、核受体及与胆汁淤积有关的主要酶类较2D模型明显上调。在肝毒性预测方面,2D模型由于无法长期培养仅能单次给药,3D聚球体模型采用单剂量及重复给药方式,通过IC50对比发现3D模型在重复给药实验中表现出更敏感的细胞毒性。结论:与2D细胞模型相比,3D HepaRG聚球体模型能够更好地用于体外肝毒性测试,并且对胆汁淤积性肝毒性也具有很好的预测能力。