3-甲基腺嘌呤对转化生长因子-β诱导大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响观察

目的观察3-甲基腺嘌呤(3-MA)对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的大鼠肝星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响。方法取对数生长期的HSC-T6细胞分为空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组。TGF-β+3-MA组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入3-MA(0.5 mg/mL)处理24 h,TGF-β+PBS组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入等量PBS处理24 h,空白组加入等量PBS处理,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-βmRNA和自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β蛋白和自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5蛋白。结果TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞活化标志物α-SMA、TGF-βmRNA和蛋白均高于空白组,且TGF-β+3-MA组均低于TGF-β+PBS组(P均<0.05)。TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA和蛋白均高于空白组,且TGF-β+3-MA组均低于TGF-β+PBS组(P均<0.05)。结论3-MA可抑制TGF-β诱导的大鼠肝星形细胞株HSC-T6活化及自噬。

IL－6依赖细胞株的克隆化、冻存及其应用

应用ＭＨ６０·ＢＳＦ２细胞检测ＩＬ－６生物学效价时，存在该细胞饲养困难和长期培养容易变异而失去ＩＬ－６增殖依赖性等问题。为此我们首先探讨了克隆化筛选ＭＨ６０·ＢＳＦ２的方法，从增殖依赖性较差的ＭＨ６０·ＢＳＦ２细胞群体中筛选到３株ＩＬ－６强依赖细胞株。并探讨了该细胞的冻存复苏方法。所冻存的细胞半年以上亦无ＩＬ－６增殖依赖性的改变。在此基础上采用ＭＴＴ比色法取代［￣３Ｈ］ＴｄＲ掺入法获得成功，从而使ＩＬ－６待测标本的生物活性检测更为方便经济。

抑瘤基因NGX6对鼻咽癌细胞株HNE1细胞生长的影响(英文)

鼻咽癌是我国南方多发恶性肿瘤 ,它的发生发展与遗传因素密切相关 .采用定位候选克隆策略在 9p上克隆出一个候选抑瘤基因 ,命名为NGX6 .为了进一步研究它的功能 ,将NGX6基因的全长cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1(+ )的表达载体中 ,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1中 ,Northern杂交方法筛选高效表达NGX6的细胞株 ,并借助细胞生长曲线、软琼脂糖集落形成实验、裸鼠体内接种实验和流式细胞仪对转染细胞的生物学行为进行了检测 .结果显示 ,转染了NGX6基因的HNE1细胞的生长速度明显减慢 ,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降 (P〈0 0 5 ) ,裸鼠体内成瘤的时间较对照组明显延长 ,瘤体的大小和重量较对照组明显减少 ,流式细胞仪检测发现细胞的凋亡率无明显变化 .为了明确NGX6蛋白在细胞中发挥作用的部位 ,进一步将NGX6的开放阅读框架完整正确地克隆到pEGFPC1的荧光载体中 ,转染到COS7细胞中 ,用荧光显微镜观察细胞中荧光的分布 ,发现荧光主要分布在细胞浆中 ,说明NGX6蛋白可能是一种胞浆蛋白 .该研究表明 ,NGX6在NPC的发生发展中起重要作用 ,为全面阐述NGX6的功能提供重要的信息 。

丹参对小鼠黑色素瘤细胞株B16-BL6侵袭和转移能力的影响

目的研究活血化瘀中药丹参对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6生长、粘附、侵袭、运动、转移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定丹参对B16-BL6细胞增殖能力的影响;采用细胞粘附实验、重组基底膜侵袭实验、趋化性运动能力实验以及小鼠黑色素瘤自发性转移模型,观察丹参对B16-BL6细胞生长、粘附、侵袭、运动及转移能力的影响。结果丹参水提液对B16-BL6细胞的增殖具有双向调节作用;能显著促进B16-BL6细胞与基底膜成分纤维粘连蛋白粘附,显著抑制B16-BL6细胞侵袭基底膜能力及趋化性运动能力;能显著减小肺转移结节体积,但对结节数目没有明显作用。结论丹参提取液能够显著减轻小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6的肺转移程度,可能与其能够抑制B16-BL6细胞对基底膜的侵袭能力以及降低B16-BL6的运动能力有关。

六君子汤对食管癌细胞株EC9706致血管生成的影响

目的研究六君子汤对食管癌血管生成的影响。方法 MTT法检测六君子汤醇提物对食管癌细胞株EC9706生长抑制作用,收集其500μg/m L质量浓度的EC9706细胞条件培养基用于鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成的观察。ELISA法检测EC9706细胞和人脐静脉内皮细胞培养基上清中VEGF和IL-6含有量。结果六君子汤醇提物可明显抑制EC9706细胞增殖,具一定剂量依赖性,其IC50值为505.28μg/m L。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞条件培养基所致鸡胚绒毛尿囊膜血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞和内皮细胞IL-6及内皮细胞VEGF分泌。结论六君子汤醇提物可能通过干预EC9706细胞信号通路从而抑制血管生成的效应。

反义RelA下调白血病耐药细胞株HL-60/E6 bcl-x_L mRNA

为了探讨NF κB对白血病耐药细胞株HL 6 0 E6bcl x基因转录的影响 ,首先在体外采用间歇小剂量表阿霉素 (6ng ml)作用于HL 6 0细胞的方法 ,建立了性能稳定的广谱耐药细胞株HL 6 0 E6。然后用RT PCR方法检测 5 μmol L硫代修饰反义RelA作用于HL 6 0 E6细胞后bcl x基因mRNA水平的变化。同时应用免疫荧光技术和流式细胞术分别对HL 6 0 E6细胞中NF κB RelA的功能状态及脂质体作为寡核苷酸载体的转染效率进行评估。结果表明 ,在HL 6 0 E6细胞中RelA表达于胞核 ,NF κB处于持续活化状态。脂质体介导的寡核苷酸 (ODN)的转染效率明显高于裸ODN组 ,在 4 ,6和12小时时有显著差异 (P <0 .0 1)。反义RelA作用于HL 6 0 E6细胞后 ,bcl xL mRNA水平下降呈时间依赖性 ,8小时抑制达到最高峰 ,15小时后逐渐恢复 ,而对照组bcl xL mRNA水平变化不明显。分析结果认为 ,NF κB对bcl x有转录调节作用 ,反义技术封闭RelA亚基可以减弱NF κB对bcl xL 基因的转录激活 ,进而推测NF κB可能是白血病细胞耐药的一个重要因子。

胡椒碱对白纹伊蚊C6/36细胞株的毒性作用

采用MTT检测法、Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测法及细胞形态学观察法,研究了植物型杀虫剂胡椒碱对白纹伊蚊Aedes albopictusC6/36细胞株的细胞毒性、诱导细胞凋亡与坏死的关系、Fas蛋白的表达、细胞生长状态改变及受损细胞的恢复。结果表明:胡椒碱浓度在0.035mmol/L以上时可以诱发C6/36细胞形态学改变,在倒置显微镜下表现为细胞呈多形性,细胞胀大或皱缩,细胞间隙增宽,大片细胞聚集成团,脱落、崩解、死亡。用胡椒碱处理24h后,对C6/36细胞的半数毒性浓度(IC50)为0.32mmol/L,且毒性作用强度随着药物浓度增加而增强。Annexin-V/PI双染法检测结果显示药物浓度在0.28mmol/L以上诱导的细胞凋亡明显,药物浓度为0.56mmol/L时细胞凋亡率达19.4%,而药物引起的细胞总死亡率为72.7%;Fas蛋白表达在药物浓度0.28mmol/L以上时有所上调,但不明显。高浓度胡椒碱(0.56mmol/L)分别作用于C6/36细胞24和48h,在经历一段生长停滞后,24h组受损细胞均可缓慢恢复,而48h组细胞则出现不可逆性的损伤。由此认为:胡椒碱对C6/36细胞株有毒性作用,但药物诱导的细胞凋亡在细胞毒性作用机制中不占主导地位;胡椒碱对C6/36细胞的作用有时间依赖性,延长作用时间,药物对细胞的毒性作用增强。

BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤细胞株L428和过表达CD99的L428中的表达差异及其意义

目的:探究BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin's lymphoma,cHL)细胞株LA28和过表达CD99的LA28(L428-CD99^+)中的表达差异及其意义。方法:应用免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦检测BCL-6和CD99在cHL细胞株LA28和LA28-CD99^+中的表达;运用实时荧光定量PCR和Western blotting检测细胞株LA28和LA28-CD99^+中BCL-6和CD99的表达水平;MTT实验检测LA28和L428-CD99^+细胞增殖能力的差异;流式细胞术检测L428和LA28-CD99^+细胞的凋亡差异。结果:免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦显示CD99在LA28细胞中为阴性表达,在L428-CD99^+细胞中为阳性表达,并定位于细胞膜;BCL-6在LA28细胞为阴性表达,在LA28-CD99^+细胞株中为阳性表达,并定位于细胞核。Western blotting显示CD99和BCL-6在LA28细胞为阴性表达,在LA28-CD99^+细胞为阳性表达。实时荧光定量PCR结果显示,与L428细胞相比,CD99和BCL-6 mRNA在LA28-CD99^+细胞中的表达量增高(P<0.01)。MTT显示LA28细胞增殖能力强于L428-CD99^+细胞(P<0.01);流式细胞术显示L428-CD99^+细胞凋亡较LA28细胞增多(P<0.01)。结论:过表达CD99诱发BCL-6表达增高,可导致L428细胞增殖能力下降及凋亡增加。

二氧化锗诱导L_6成肌细胞株的MyoD基因表达

目的:探讨成肌细胞的MyoD基因在线粒体肌病发生发展中的作用。方法:采用二氧化锗(GeO2)处理大鼠的成肌细胞系L6,观察细胞形态的变化,利用MTT分析GeO2对成肌细胞的影响,用RT-PCR检测MyoD基因表达。结果:发现GeO2在损伤成肌细胞的同时,能够诱导MyoD基因的表达,表明MyoD基因在线粒体肌病的发生发展中起着重要作用。结论:MyoD基因表达的增强是线粒体肌病中骨骼肌萎缩的一个信号分子,MyoD基因表达有可能成为线粒体肌病检测的参考指标。

中药清热降浊方对IEC-6细胞株增殖与凋亡的影响

目的:观察清热降浊方对IEC-6细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用MTT比色法计算清热降浊方干预后的IEC-6细胞存活率,观察清热降浊方对IEC-6细胞增殖的影响;采用Annexin V-FITC和PI双标流式术检测清热降浊方对IEC-6细胞凋亡的影响。结果:清热降浊方干预24 h后,与正常胎牛血清培养相比,低浓度中药复方组细胞存活率显著增加(P<0.01),其中2.5%浓度含药血清组细胞存活率最高(162.42%),故选用2.5%浓度含药血清作为工作浓度。通过流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示,清热降浊方干预24 h后,不同葡萄糖状态下细胞的凋亡率均明显下降。相比高糖(正常培养,加胎牛血清)组,高糖加含药血清组细胞凋亡率下降了7.92%;相比低糖(加胎牛血清)组,低糖加含药血清组细胞凋亡率下降了10.92%。结论:清热降浊方能够促进IEC-6细胞增殖,减少细胞自然凋亡。

雷公藤多甙对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖和IL-6分泌的影响

目的:观察雷公藤多甙对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖和IL-6分泌的影响,探讨其治疗类风湿性关节炎的作用机理。方法:培养大鼠滑膜细胞株RSC-364,运用CCK-8法检测不同剂量的雷公藤多甙对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖的影响,酶联免疫吸附实验检测细胞株培养上清中的IL-6的含量。结果:经过IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364,在不同浓度的雷公藤多甙的作用48h后,其增殖明显受到抑制,并呈剂量依赖性。同时各剂量组均可抑制IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌炎性因子IL-6的分泌。结论:雷公藤多甙抑制IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364的过度增殖和IL-6的分泌,这可能是其治疗类风湿性关节炎的作用机理之一。

小肠隐窝细胞株(IEC-6):中药生物活性成分筛选的药理模型

目的:利用小肠隐窝细胞株(IEC-6)作为模型,筛选党参的生物活性成分。方法:IEC-6细胞以1×104的密度接种于96孔培养板,加入200μL含有50m l/L超滤胎牛血清、10mg/L胰岛素及50mg/L庆大霉素的DMEM培养液,24小时后,分别用胃泌素、党参提取物A、B、C、D治疗,对照组用D-PBS。细胞培养24小时后,用MTT法观察细胞增殖,细胞培养12小时后,分别用RT-PCR方法、放射技术和高效液相色谱方法检测细胞鸟氨酸脱羧酶(ODC)mRNA水平、ODC活性及细胞内腐胺含量。结果:与对照组比较,胃泌素明显促进IEC-6细胞增殖,明显增加ODC mRNA水平、ODC活性及细胞内腐胺含量。党参提取物A、B、C、D以剂量依赖方式作用于IEC-6细胞,提取物A 250mg/L^2000mg/L、提取物B 125mg/L^2000mg/L、提取物C 2000mg/L及提取物D250mg/L^2000mg/L明显促进细胞增殖,而提取物C 30mg/L和125mg/L抑制细胞增殖。结论:通过检测中药对细胞增殖的调节作用,IEC-6细胞可以作为黏膜损伤修复药物筛选的药理模型,方法简单,结果准确。

IL-6在人胃癌细胞株AGS中生物学效应及其信号传导途径

目的探讨白细胞介素6(I-L6)在人胃腺癌细胞株AGS中产生生物学效应的信号传导途径。方法通过MTT法检测IL-6刺激AGS细胞后对其生长增殖的影响;采用电泳迁移变动试验(EMSA)和Westernblot观察IL-6刺激前后AGS细胞中IL6相关转录因子Stat3和参与IL-6信号传导功能的蛋白激酶Jak1的诱导活化状态,并确定该细胞中的IL6信号传导通路;通过免疫细胞化学染色确定磷酸化Stat3在AGS细胞内的定位。结果IL-6可显著促进AGS细胞的增殖;转录因子Stat3和蛋白激酶Jak1都能在AGS细胞中被IL-6诱导激活,且Stat3的活性与IL6的刺激呈一定的剂量和时间依赖性;磷酸化Stat3的染色定位于AGS细胞核。结论JAK/STAT信号传导途径的活化介导了IL-6对AGS细胞增殖的促进功能。

四君子汤总多糖及各单味药多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞增殖的影响

目的研究四君子汤总多糖及各单味药多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞增殖的影响。方法以IEC-6细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,观察四君子汤总多糖及各单味药多糖对该细胞增殖的影响。结果各多糖的作用存在差异,茯苓多糖具有明显的促进细胞生长的作用,甘草多糖与党参多糖作用不显著,而白术多糖则具有明显的抑制细胞生长的作用。当采用每两味多糖组合时,结果表明所有两组多糖作用强度远不如四君子汤总多糖。结论四君子汤总多糖的作用可能是各种单味药多糖综合作用的结果,也提示中药复方用药具有一定的合理性。

疏肝健脾方联合解毒抗癌方对人肝癌细胞株HpG2 IL-6和IGF-IR影响随机平行对照研究

[目的]观测疏肝健脾方联合解毒抗癌方对人肝癌细胞株HpG2 IL-6和IGF-IR影响。[方法]使用疏肝健脾方、解毒抗癌方和HpG2细胞株共同培养24h、48h、72h和96h后进行MTT、IL-6 ELISA和IGF-IR ELISA检测,使用顺铂作为对照组。[结果]MTT抑制率11.1%,解毒抗癌方为72.8%,顺铂为74.7%。疏肝健脾方和解毒抗癌方(χ2=1.600,P=0.000<0.01)。顺铂与HpG2(P=0.001<0.01);解毒抗癌方与HpG2(P=0.008<0.01),疏肝健脾方与HpG2比较,(P=0.752>0.05)。IGF-IR,顺铂与HpG2(P=0.001<0.01);解毒抗癌方与HpG2(P=0.004<0.01)。疏肝健脾方与HpG2(P=0.860>0.05)。IGF-IR,顺铂与HpG2(P=0.001<0.01);解毒抗癌方与HpG2(P=0.004<0.01)。疏肝健脾方与HpG2(P=0.860>0.05)。[结论]疏肝健脾方和解毒抗癌方对HpG2细胞株的作用不同,解毒抗癌方直接杀灭肿瘤细胞,其作用可能是抑制IL-6和IGF-IR的分泌而促使肿瘤细胞凋亡;疏肝健脾方对HpG2细胞株无作用。

赤芍水提物对肝星状细胞株HSC-T6促凋亡作用的实验研究

目的应用流式细胞法,研究灌服赤芍水提物后的犬血清对乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6细胞的促凋亡作用。方法采用乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6作为体外研究模型,以赤芍水提物给彼格犬一次性灌胃,取给药前的血清、给药后1h、2h、3h、5h血清作为实验药物血清。以流式细胞法(flow cytometry)分别检测以上采血时间点上2%浓度的药物血清对乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6作用72h后的促凋亡作用。结果2h、3h两个时间点的含药血清能明显促进HSC-T6细胞的凋亡,其中2h2%含药血清的促凋亡率5.71%,3h2%含药血清的促凋亡率5.73%。和同样条件下用空白血清培养的HSC-T6细胞相比其凋亡比例显著性增加(均为P<0.05)。在药物血清的作用下两个时点组的HSC-T6细胞在G0/G1期细胞比例明显上升(P<0.05);而S期细胞显著减少(P<0.05);但G2/M期并没有一致性的变化。结论两个时点的药物血清对HSC-T6细胞都有显著的促凋亡作用,且能显著增加HSC-T6细胞在G0/G1期的比例及显著降低S期的比例,这可能是其抑制HSC-T6细胞增殖及促凋亡的原因之一。

小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长

目的建立一过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株，研究其在低葡萄糖环境中的生长特性。方法将全长Reg3α cDNA插入到质粒载体pcDNA3．1中，并将Reg3α-pcDNA3．1和pcDNA3．1空载体用脂质体法转染胰岛MIN6细胞，分别获得Reg3α cDNA过表达和空载体pcDNA3．1MIN6细胞。应用Real—time PCR和Western blot方法检测这两种细胞在低葡萄糖培养基中Reg3α的表达，并用MTT法测定Reg3α过表达对MIN6细胞生长的影响。结果有三株Reg3α转染的细胞株显示Reg3α的高表达，在空载体转染的MIN6细胞株中未检测到Reg3α的表达，Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍。用Western blot检测发现Reg3α蛋白释放到培养液。采用MTT法测定，与空载体转染的MIN6细胞株相比，三株Reg3α稳定转染细胞株，7d后细胞数目升高2倍。结论本研究结果表明已成功地建立了过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞。Reg3α可能具有内分泌作用，促进胰岛细胞生长。

Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏骨髓来源树突状细胞瘤苗的抗肿瘤免疫学效应

目的：研究Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的抗肿瘤免疫生物学效应.方法：用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏BMDCs制成瘤苗,瘤苗的效应通过C57BL/6J小鼠肝细胞癌模型验证.皮下接种Hepal-6细胞8d后,成瘤小鼠随机分实验组,足垫部皮下注射Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏BMDCs;无血清RPMI-1640注射组、BMDCs注射组和单纯Hepal-6细胞裂解蛋白致敏BMDCs注射组.取肿瘤组织分离成细胞悬液,FACS检测CD11c＋细胞、CCR7＋细胞、CD80＋细胞和CD86＋细胞;取淋巴结、脾、肿瘤冷冻切片并采用免疫组织化学检测淋巴结、脾、肿瘤内Foxp3＋细胞浸润的改变;ELISA检测瘤内转化生长因子-p1（TGF-β1）、白细胞介素-10（IL-10）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）的表达.结果：实验组肿瘤组织比各对照组有更多的CD11c＋细胞、CCR7＋细胞、CD80＋细胞和CD86＋细胞浸润;与各组对照相比较,实验组Foxp3＋细胞在淋巴结、脾、肿瘤内浸润明显减少;实验组细胞因子TGF-β1、IL-10低于各对照组,IFN-γ、IL-2则高于各对照组.结论：Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗能促进DCs在瘤内浸润和成熟,减少Foxp3＋细胞在肿瘤内的浸润,下调免疫抑制细胞因子TGF-β1、IL-10和上调免疫促进因子IFN-γ、IL-2分泌,有较强的抗肿瘤免疫生物学效应.

Apigenin/GCV对C_6-TK细胞株的杀伤效应及作用机制

目的探讨Apigenin/GCV对体外培养鼠胶质瘤C6细胞的杀伤效应及作用机制。方法对含有导入pcDNA3-TK质粒的C6细胞进行培养、传代:通过MTT法、TUNEL实验法及光镜技术检测GCV/Apigenin对检测不同组别C6细胞C6-TK细胞株的杀伤效应。结果给GCV+Apigenin后:转染组、空载体组和对照组中两两比较:转染组的细胞增殖水平显著低于空载体组和对照组(P<0.05);相对未处理组,用10μmol/LApigenin预先处理6h后,GCV对C6混合细胞的杀伤效应显著增强(P<0.01)。结论缝隙连接功能上调剂Apigenin可显著提高HSV-TK/GCV肿瘤自杀基因系统的"旁观者效应"及显著促凋亡作用。GCV的作用效能对细胞间通讯功能有一定的依赖性。