HPI在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞特异性抑增殖效应研究

肝细胞增殖抑制因子（Ｈｅｐａｔｉｃｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＨＰＩ）粗制品、半纯品和纯品对体外培养的人肝癌细胞具有显著抑增殖作用，随样品纯度提高抑制活性逐渐增强。纯品（浓度５μｇ／ｍｌ）的抑制率达７７．７１％。正常成年大鼠肝细胞呈ＨＰＩ阳性表达。在ＤＥＮ诱发大鼠肝细胞癌的发生发展过程中，转化的癌前期细胞和肝癌细胞呈ＨＰＩ阴性表达。表明肝细胞ＨＰＩ的表达能力在其癌变过程中消失，从而失去了自身的抑癌作用。

PI3K抑制剂对四氯化碳刺激的肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂对四氯化碳(CCl4)刺激的肝星状细胞(HSC)增殖和Ⅰ型胶原表达的影响,为肝纤维化的治疗提供理论基础。方法将液氮保存下的HSC株,于37℃,50mL/L CO2孵育箱中复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白对照组、CCl4组、CCl4+1μmol/L PI103组、CCl4+2μmol/L PI103组、CCl4+4μmol/L PI103组,分别培养48h。用透射电子显微镜初步观察了细胞形态改变;MTT比色法测定细胞增殖情况;免疫细胞化学测定细胞的Ⅰ型胶原表达情况。结果 CCl4组与空白对照组比较,细胞生长旺盛,细胞数目增多,Ⅰ型胶原表达增多;透射电子显微镜下可见CCl4+4μmol/L PI103组比CCl4组凋亡细胞显著增多,细胞数目减少;MTT和免疫细胞化学实验结果显示,与CCl4组比较,CCl4+1μmol/L PI103组、CCl4+2μmol/L PI103组、CCl4+4μmol/L PI103组细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,随着PI103剂量加大,细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,但CCl4+4μmol/L PI103组和CCl4+2μmol/L PI103组比较,细胞的增殖无明显变化。结论 PI3K抑制剂PI103可抑制活化的HSC的增殖,促进其凋亡以及减少其Ⅰ型胶原的表达。

大蒜素对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响

目的观察大蒜素对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖及细胞外基质降解酶-金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的影响,探讨大蒜素抗肝纤维化的作用及其机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6。MTT法检测大蒜素作用下对大鼠肝星状细胞增殖的影响、Real-time RT-PCR检测肝星状细胞的TIMP-1mRNA水平、Western blot检测肝星状细胞的TIMP-1蛋白的表达水平。结果 HSC-T6大蒜素处理组与空白对照组比较,增殖抑制率明显提高,差异有统计学意义(P<0.01);TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平均明显下降,并且大蒜素浓度增高时,TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平则逐渐下降,大蒜素高浓度(24μg/mL)组对TIMP-1的抑制作用明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大蒜素对HSC-T6增殖和TIMP-1的表达均有抑制作用,为临床开发抗肝纤维化的新药物提供了理论基础。

丙戊酸钠对肝癌SMMC-7721细胞增殖和细胞周期的影响及机制

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、细胞周期及对p21WAF1/CIP1mRNA表达的影响.方法:实验分为空白对照组、PBS组、VPA0.2mmol/L组、VPA1.0mmol/L组和VPA5.0mmol/L组.不同浓度VPA干预人肝癌SMMC-7721细胞24h、48h和72h,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期;干预72h后,用Real-timePCR法检测VPA干预72h后p21WAF1/CIP1mRNA的表达情况.结果:与空白对照组及PBS组比较,不同浓度的VPA作用24h,48h及72h时组肝癌SMMC-7721细胞增殖均出现了不同程度抑制(请将具体数据列出来P<0.05),随着VPA药物浓度升高,细胞增殖抑制作用逐渐增强,随作用时间延长,抑制程度逐渐增强(P<0.05).随药物浓度升高,G1期细胞比例逐渐增多,S期细胞比例逐渐减少,细胞发生G0/G1期阻滞.VPA干预肝癌SMMC-7721细胞72h后,VPA组p21WAF/CIP1mRNA表达较空白对照组及PBS组表达明显升高(请将具体数据列出来P<0.01).结论:VPA可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,且呈时间及剂量依赖性,并诱导出现G0/G1细胞周期阻滞,同时上调p21WAF1/CIP1mRNA的表达.

卵泡抑素对肝纤维化大鼠细胞增殖及激活素A的影响

目的研究基因重组人卵泡抑素(recombinant humanfollistatin,rh-FS)对实验性肝纤维化大鼠增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrDU)核标记及激活素 A(activin A,ActA)表达的影响.方法采用400 mL·L^(-1)四氯化碳(CCl_4)sc 制备大鼠实验性肝纤维化模型,将16只肝纤维化模型组大鼠随机分成 rh-FS 处理组和假手术组,另外8只大鼠不作任何处理作为正常对照.rh-FS(1μg)经大鼠回结肠静脉注入 rh-FS 处理组大鼠门静脉内,24 h 后处死动物,免疫组织化学法检测正常大鼠肝脏、rh-FS 处理组和假手术组 PCNA,BrDU 核标记及 Act A 的表达.结果 rh-FS 可明显增强肝纤维化大鼠肝细胞 PCNA(FS 处理组 PCNA 核标记19%±7%,假手术组3%±2%,n=8,P<0.01)和 BrDU(FS 处理组 DrDU 染色+,假手术组染色-,n=8)核标记,二者变化相似;肝纤维化时 Act A 表达增加(正常大鼠肝脏+,肝纤维化时++～+++),且其分布发生改变,rh-FS 短时间作用对 Act A 表达无明显影响.结论 rh-FS 可促进纤维化肝脏肝细胞增殖.

黄芪总皂苷对瘦素诱导的HSC增殖和TIMP-1上调的影响

目的观察黄芪总皂苷对瘦素诱导的肝星状细胞(HSC)增殖及组织抑制基质金属蛋白酶-1(TIMP-1)分泌的影响。方法培养HSC,分为溶媒组、溶媒瘦素组和黄芪总皂苷组。磺酰罗丹明B法检测HSC增殖,利用2,7-二氯二氢荧光素二乙酯作为探针检测HSC中的活性氧水平,酶联免疫吸附实验测定HSC培养液中TIMP-1含量。结果黄芪总皂苷50、100、200μg/mL与溶媒瘦素组相比,明显抑制瘦素诱导的HSC增殖(P<0.01),抑制率分别达29.1%、66.7%和86.1%,同时能够抑制瘦素诱导HSC的活性氧产生(P<0.05)以及TIMP-1的分泌(P<0.05)。结论黄芪总皂苷可能通过下调瘦素诱导的氧化应激水平,从而抑制HSC增殖以及TIMP-1的分泌。

扶正化瘀方对非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗作用

目的观察扶正化瘀方对非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体-／（peroxisomeproliferatoractivatedreceptor—gamma，PPAR7）和相关炎性因子及纤维化因子表达的影响，以探明扶正化瘀方阻止脂肪性肝纤维化进展的作用机制。方法选用7～8周龄健康雄性C57BI。／6J小鼠，高脂、蛋氨酸胆碱缺乏（methionineandcholinedeficient，MCD）饮食喂养8周，建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型，分别采用扶正化瘀方、血红素氧合酶1（hemeoxygenase-1，HO1）激动剂血晶素、扶正化瘀方联合血晶素进行干预实验，以蛋氨酸胆碱充足饮食为对照组。HE染色及Masson染色观察肝脂肪变、炎性反应及纤维化程度；分别采用RT—PCR、实时定量RT—PCR和Western印迹检测肝组织PPAR7、Ii。1O、基质金属蛋白酶2（matrixmetalloproteinase2，MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制因子1（tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase1，TIMP1）mRNA及蛋白的表达。结果模型组小鼠肝组织出现大泡性为主的混合性肝细胞脂肪变、点灶状肝细胞坏死及炎细胞浸润、汇管区纤维组织增生及窦周纤维化，肝组织PPAR7mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低，mRNA、MMP2和TIMP1mRNA及蛋白表达较对照组显著升高。应用扶正化瘀方、血晶素或扶正化瘀方联合血晶素干预后肝损伤显著改善，伴肝组织PPAR．ymRNA及蛋白表达上调（P〈O．05）及IL1（1mRNA、MMP2和TIMP1mRNA及蛋白表达下调（P〈0．05），尤以扶正化瘀方联合血晶素组效果显著。结论扶正化瘀方可通过调节PPAR—Y及相关炎性反应及纤维化因子的表达阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生发展，尤以联合应用血晶素效果为佳。

丙戊酸钠逆转组蛋白低乙酰化水平对肝癌细胞侵袭转移的体外实验研究

目的探讨丙戊酸钠(VPA)逆转组蛋白低乙酰化水平对体外培养的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞体外侵袭、转移能力的影响及其可能的作用机制。方法流式细胞仪(FCM)分析不同浓度VPA对SMMC-7721细胞凋亡及细胞周期的影响;分别采用划痕试验,Transwell侵袭小室和细胞-基质黏附试验测定细胞体外迁移、侵袭和黏附能力;Western blot观察不同浓度VPA处理后HPA和PCNA蛋白的表达变化。结果 VPA诱导SMMC-7721细胞凋亡,阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖。VPA试验组细胞的侵袭、迁移能力以及黏附能力均显著低于对照组(P<0.05)。随浓度和时间增加,VPA能明显降低HPA和PCNA蛋白表达。结论 VPA可通过逆转染色体组蛋白低乙酰化水平,显著抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞侵袭、迁移和黏附能力。下调HPA和PCNA表达可能是其发挥作用的主要机制之一。

肝细胞增殖抑制因子抗血清的制备及其肝内原位表达

用９０％纯度的肝细胞增殖抑制因子（ＨＰＩ）制备了效价为１∶３２的兔抗鼠ＨＰＩ抗血清，并检测了ＨＰＩ在肝内的原位表达。结果表明，正常成年大鼠、兔和豚鼠肝细胞均表达ＨＰＩ，肝小叶中央带肝细胞表达尤强，非肝细胞无ＨＰＩ表达。胎鼠和新生鼠肝细胞及非肝细胞无ＨＰＩ表达。肾内各处结构和细胞也无ＨＰＩ表达。在肝大部切除后１～２ｄ，肝细胞无ＨＰＩ表达，４ｄ后呈弱阳性表达并逐渐增强，至１０ｄ时达正常成年鼠表达水平。在肝癌发生中，转化肝细胞和肝癌细胞无ＨＰＩ表达。研究结果提示。

维生素C和E对瘦素诱导的肝星状细胞增殖与TIMP-1上调的抑制作用

目的观察维生素C和E对瘦素诱导肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的增殖及组织抑制基质金属蛋白酶-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)上调的影响。方法培养人HSC,按照分组加入瘦素和(或)不同浓度的维生素C和E。磺基罗丹明B法检测HSC增殖,活性氧(ROS)检测探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酯检测ROS,酶联免疫吸附实验测定TIMP-1的浓度。结果维生素C为100、200、400μmol/L时抑制瘦素诱导的HSC增殖效果和瘦素组比较差异有统计学意义(P<0.05),维生素E为80、160、320μmol/L时与溶媒瘦素组比较差异有统计学意义(P<0.05)。最高浓度联合后,抑制瘦素诱导的HSC增殖效果更明显(P<0.05)。同时上述浓度均能抑制瘦素诱导的ROS产生(P<0.05),抑制瘦素诱导的TIMP-1产生(P<0.05),最高浓度联合组抑制TIMP-1效果较单独用药时明显(P<0.05)。结论抗氧化剂维生素E和C可能通过抑制瘦素诱导的氧化应激,抑制HSC增殖以及TIMP-1的产生。

钙调蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN62对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的研究钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN62对转化生长因子-β1(transforming growth factor⁃β1,TGF⁃β1)刺激的LX2肝星形细胞(LX2 hepatic stellate cells,LX2⁃HSCs)增殖、凋亡的影响及可能的机制。方法取1、5、10、20μmol/L KN62作用于LX2,各培养1、3、6、12、24 h,CCK⁃8法检测细胞增殖并依据其结果分为5个实验组:空白对照组,5 ng/mL TGF⁃β1组,低、中、高浓度KN62(1、5、10μmol/L)+TGF⁃β1组。TUNEL法检测细胞凋亡,Western Blot检测CaMK II、Bcl⁃2、Bax及caspase⁃12蛋白表达。结果KN62作用6 h后不同时间点,各浓度组OD值比较差异均有统计学意义(P<0.05),但20μmol/L与10μmol/L比较差异均无统计学意义(P>0.05);低、中、高浓度KN62+TGF⁃β1组细胞增殖率分别为82.3%、67.4%、50.1%,凋亡率分别为(30.8±6.1)%、(54.5±4.5)%、(75.7±5.6)%,差异均有统计学意义(F=80.070,P<0.001;F=73.199,P<0.001);各浓度KN62组均能降低CaMKII(F=84.355,P<0.001)及Bcl⁃2蛋白表达(F=110.896,P<0.001),增加Bax蛋白表达(F=156.086,P<0.001),致Bcl⁃2/Bax比值降低;随KN62浓度增加,procaspase⁃12和cleaved caspase⁃12蛋白表达均升高(P<0.001)。结论CaMKⅡ抑制剂KN62能够抑制LX2增殖并诱导其凋亡,可能与caspase⁃12依赖性内质网应激凋亡途径有关。

过表达Raf激酶抑制蛋白(RKIP)抑制人肝星状细胞增殖

目的研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)对LX-2人肝星状细胞增殖的影响。方法用重组质粒pc DNA3.1-RKIP转染LX-2细胞,G418筛选并培养稳定转染的细胞。MTT法和集落形成试验检测过表达RKIP对LX-2细胞增殖、集落生成的影响;Western blot法检测RKIP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、1型胶原蛋白(Col1)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2及胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路相关蛋白的表达水平。结果与对照细胞相比,过表达RKIP明显抑制LX-2细胞增殖和集落形成,下调Col1、α-SMA、MMP-1和MMP-2蛋白表达,降低ERK/MAPK磷酸化水平。结论过表达RKIP抑制LX-2细胞的增殖,其机制与抑制ERK/MAPK信号通路有关。

原花青素对瘦素诱导肝星状细胞增殖和TIMP-1产生的影响

目的观察原花青素(PC)对瘦素诱导的肝星状细胞(HSC)增殖及组织抑制基质金属蛋白酶-1(TIMP-1)产生的影响。方法磺基罗丹明B法检测HSC增殖,利用活性氧(reactive oxygen species,ROS)探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酯检测ROS,酶联免疫吸附实验测定TIMP-1的浓度。结果 PC在50、100、200μg/mL时能够抑制瘦素诱导的HSC的增殖(P<0.05),同时能够抑制瘦素诱导的ROS的产生(P<0.05),上述PC各浓度组亦能够抑制TIMP-1的产生(P<0.05),浓度之间抑制效果具有统计学差异(P<0.05)。结论 PC可能通过抑制瘦素诱导的氧化应激,抑制HSC的增殖以及TIMP-1的产生。

罗格列酮对肝星状细胞基质金属蛋白酶抑制因子1、2基因表达的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）特异配体罗格列酮对肝星状细胞（HSC）表达基质金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）、TIMP-2的影响.方法 在培养的HSC株中加入不同浓度的罗格列酮（终质量浓度为5、10、15、20 μmol/L）,于24h后收集细胞,利用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达水平.结果 TIMP-1 mRNA表达水平在罗格列酮5、10、15、20 μmol/L组分别为1.8087±0.0642、1.3517±0.0485、0.9510±0.0835、0.5653±0.0879;而空白对照组为2.0508±0.1576.TIMP-2 mRNA表达水平在罗格列酮5、10、15、20 l,mol/L组分别为3.1314±0.0717、2.0758±0.0730、1.4718±0.0623、0.8566±0.0744;而空白对照组为3.5784±0.0956.结论 PPARγ特异配体罗格列酮可抑制HSC表达TIMP-1、TIMP-2,并在一定范围内呈剂量依赖性.