甲型肝炎病毒TZ84株单克隆抗体在甲肝病毒抗原检测中的应用

目的研究甲型肝炎病毒TZ84株单克隆抗体在甲肝病毒抗原检测中的应用,以期代替现有试剂中的多克隆抗体,得到灵敏度高、特异性好、重复性和准确性好的甲肝抗原检测试剂。方法采用双抗体夹心法将甲肝多抗包被96孔酶标板后,加入甲肝抗原,分别用酶标单抗和酶标多抗两种方法进行检测甲肝抗原,对单抗试剂的真实性和可靠性进行评价。结果单抗试剂的灵敏度为100%、特异度为100%,变异系数均小于15%。结论单抗试剂可用于甲肝抗原的定性和定量检测,结果准确可靠。

Walvax-2细胞基质培养甲型肝炎病毒YN5株的遗传稳定性分析

目的分析Walvax-2细胞基质培养甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)YN5株的遗传稳定性。方法将HAV YN5株在Walvax-2细胞中于35℃连续适应培养,取P24、P27、P29、P35和P40代病毒,提取RNA,以其为模板进行RT-PCR扩增,并测序。采用生物信息学软件DNAMAN、Vector NTI、BioEdit等进行序列分析,与GenBank中登录的标准株HM175(M14707)进行同源性比较。结果 5代病毒全基因组间的核苷酸序列同源性为100%。与标准株HM175比较,5代病毒基因组5′-NCR(101～200 bp)片段的124和152位发生突变,且存在134～137 bp缺失;2A(3 012～3 210 bp)片段的3 025和3 196位发生突变,其中,3 025位点A变为T,与标准株HM175 VP1/2A(3 024～3 191 bp)的差异小于7. 5%,基因亚型与其相同,均为IB型;2C(3 986～4 960 bp)片段的4 043、4 087、4 185、4 222、4 563、4 802、4 880位点发生突变。5代病毒与标准株HM175氨基酸序列同源性为99. 4%,共有29个氨基酸发生突变,主要抗原位点与标准株HM175完全一致。结论 Walvax-2细胞基质培养HAV YN5株可保持良好的遗传稳定性,有望用于甲肝疫苗的研发及生产。

甲型肝炎病毒Vero细胞适应株的选育研究

将甲肝患者粪便中分离的甲型肝炎病毒在Vero细胞中进行适应性培养 ,选育高滴度适应株应用于甲肝灭活疫苗研究。在Vero细胞上连续传代 ,测抗原滴度和感染性滴度 ,满意后按WHO推荐的甲型肝炎灭活疫苗规程进行灭活疫苗试制研究。经Vero细胞 14次适应性传代后 ,病毒抗原滴度可高达 1∶2 5 6 0 ,感染性滴度为 8.2 3LogC CID50 /ml。试制的灭活疫苗HPSEC检测在 2 80nm时仅有一个高峰 ,SDS PAGE电泳 ,在 2 2kD、2 6kD和 33kD处有三条蛋白带 ,和HAVVP3、VP2和VP1的位置相同。ICR小鼠效力试验表明疫苗剂量 16 0 0EU/ml与Merck疫苗5 0U效果相似。通过研究获得了Vero细胞甲肝病毒适应株YN5株 ,初步证明可作为甲型肝炎灭活疫苗的候选毒株。

甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性

目的研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件。方法将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定。结果甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID_(50)/mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24~28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU/mL和7.24 lgCCID_(50)/mL。三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础。

甲型肝炎病毒L-A-1株在人胚肺二倍体细胞2BS株上的遗传稳定性

目的探讨甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)L-A-1株在人胚肺二倍体细胞2BS株(简称2BS细胞)上的遗传稳定性。方法将HAV L-A-1株在2BS细胞上连续传代培养至32代,取23、24、26、28和32代次病毒,检测抗原含量和病毒滴度。RT-PCR扩增各代病毒HAV1~HAV7基因序列片段,采用DNAMAN软件进行拼接,得到全基因组核苷酸序列,分析不同代次病毒基因组核苷酸和氨基酸同源性;并与GenBank中登录的国内外主要HAV毒株进行同源性分析,同时比对VP1和VP3区氨基酸序列。各代次病毒液经腹腔免疫ICR小鼠,0.5 m L/只,于免疫后28 d,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测血清抗体效价。结果HAV L-A-1株23、24、26、28和32代次病毒抗原含量在10240~20480 EU/mL之间,病毒滴度为7.00~7.50 lgCCID50/mL。不同代次HAV L-A-1株病毒全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%;与国内外主要HAV毒株的核苷酸序列同源性为91.40%~99.70%,氨基酸序列同源性为98.20%~99.69%,与L-A-1参考株(AF314208)核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为99.70%和99.69%;与国内外主要HAV毒株VP1区有5处氨基酸不一致,VP3区有2处氨基酸不一致,与L-A-1参考株(AF314208)和H2减毒株(H2K25株)VP1和VP3区氨基酸序列完全一致。不同代次病毒液免疫ICR小鼠后阳转率均为100%,血清抗体效价在684.69~997.84 mIU/mL之间,各代病毒间差异无统计学意义(P>0.05)。结论HAV L-A-1株在2BS细胞上连续传代后,具有良好的遗传稳定性。

甲型肝炎病毒SYX1株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性

目的探讨甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)SYX1株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性。方法将来源于甲肝患者粪便的HAV SYX1株接种至MRC-5细胞,连续传代至第28代,检测第1~26代病毒的抗原含量和病毒滴度;镜下观察第6代病毒的形态,并检测其理化性质。取第13~15代病毒进行病毒增殖动态研究,确定病毒增殖高峰期。选择第8、12、18、20、22、25、26和28代病毒,提取病毒基因组RNA进行序列测定,分析其遗传稳定性。建立HAV SYX1株主种子批和工作种子批,按照《中国药典》三部(2020版)要求进行检定。结果HAV SYX1株在MRC-5细胞上连续传至8代后,抗原含量稳定在160~320 EU/mL之间,病毒滴度维持在7.3~8.3 lgCCID_(50)/mL;病毒颗粒有空心和实心两种类型,直径为27~32 nm,呈球形,无包膜,表面无突起;可耐受低pH及乙醚。确定病毒增殖高峰期为10 d,抗原含量达160 EU/mL以上,病毒滴度达7.0 lgCCID_(50)/mL以上。HAV SYX1株为HAV IB亚型,传代过程中所有结构蛋白编码区基因序列未发生突变。HAV的主种子批和工作种子批的各项检定结果均符合相关要求。结论HAV SYX1株在MRC-5上传代具有良好的适应性及遗传稳定性,可用于甲肝灭活疫苗的研究及生产。

甲型肝炎病毒TZ84株单克隆抗体在甲型肝炎抗体检测中的应用

将不同位点的甲型肝炎 (甲肝 )病毒 (HAV)TZ84单克隆抗体 (单抗 )或酶标单抗进行混合做包被和酶 ,代替现有试剂中的多克隆抗体 (多抗 ) ,采用竞争抑制法对试剂的灵敏度和可靠性进行测定 ,并通过 2 2 9份甲肝灭活疫苗临床观察血清甲肝病毒抗体的检测 ,对单抗试剂的应用进行研究 ,并对该单抗试剂进行评价。结果表明 :该单抗试剂的灵敏度为 94 % ,特异度均为 98% ,最低检出浓度的变异系数为 9 3% ;单抗试剂、多抗试剂和雅培试剂的最低检出浓度分别为 5 5、98、31mIU/ml。单抗试剂的灵敏度高于多抗试剂 ,特异度低于多抗试剂。