广州无偿献血人群中丙型肝炎抗体阳性者HCV基因型与病毒载量的关系

目的:了解最新广州地区无偿献血人群丙型肝炎病毒(HCV)基因型与病毒载量的关联性。方法:收集2008～2011年广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本605份,采用荧光定量PCR(Q-PCR)的方法对其进行核酸及病毒载量检测,阳性标本作NS5B基因扩增;核苷酸序列测定后运用DNASTAR、BioEdit和Mega4.0等软件作序列分析和基因分型,采用SPSS16.0软件对病毒载量与基因型(亚型)的关联性进行分析。结果:337份HCV RNA阳性的标本扩增出NS5B基因320份,HCV 1b、6a、3a、2a、3b、1a、6n比例依次为45.00%、33.44%、8.75%、7.81%、4.38%、0.31%和0.31%。HCV1b与2a、3a、6a、6a与2a、3a之间病毒载量存在显著差异:HCVba病毒载量高于2a、3a和6a,HCV6a病毒载量高于2a和3a。结论:广州地区无偿献血人群中HCV1b和6a为主要亚型且其病毒载量高于其他亚型。

云南和山西无偿献血人群HCV部分基因的核苷酸序列测定及基因分型

目的了解云南和山西2地无偿献血人群丙型肝炎病毒(HCV)的基因型分布及其差异。方法采用荧光定量PCR(Q-PCR),对所收集的203份ELISA检测抗-HCV阳性的无偿献血者标本(云南102份,山西101份)做核酸检测,对核酸阳性的标本做E1基因扩增和测序;E1基因阴性者,进一步做NS5B基因扩增;采用DNASTAR、Bi-oedit和Mega4等软件对E1、NS5B基因进行分析及分子进化研究。结果203份ELISA检测抗-HCV阳性的无偿献血者标本中,云南102份标本经Q-PCR检测出核酸阳性55份,从中扩增出E1基因43份,补做NS5B基因扩增获得阳性结果8份;山西省101份标本经Q-PCR检测出阳性46份,从中扩增出E1基因33份,补做NS5B基因扩增获得阳性结果6份。云南省献血者HCV基因型(亚型)可分为7种:1b[7.84%(4/51)]、2a[13.73%(7/51)]、3a[17.65%(9/51)]、3b[41.18%(21/51)]、6a[7.84%(4/51)]、6n[9.80%(5/51)]和6v[1.96%(1/51)];山西省献血者HCV基因型(亚型)较简单,可分为3种:1b[89.74%(35/39)]、2a[7.69%(3/39)]和3b[2.56%(1/39)]。结论我国云南和山西2地无偿献血人群中的HCV基因型(亚型)的分布存在明显的差异。

广州地区无偿献血人群HCVE1和NS5B基因的测序和分型

目的了解广州地区无偿献血人群丙型肝炎病毒部分基因的核苷酸序列和基因型分布。方法收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本201份,采用荧光定量PCR(Q-PCR)的方法对其进行核酸检测,阳性标本同时作HCVE1和NS5B基因扩增;核苷酸序列测定后运用DNASTAR,B ioEd it,M ega4.0等软件作序列分析和基因分型。结果 201份抗-HCV阳性标本的HCV RNA阳性率为54.23%(109/201),其中男性的HCV RNA阳性率为63.19%(91/144)、女性为31.58%(18/57)(P<0.05)。109份HCV RNA阳性的标本全部扩增出E1和NS5B基因,基因分型显示其HCV基因型比例依次为1b(46.79%)、6 a(33.03%)、3 a(10.09%)、2 a(5.50%)、3b(3.67%)、1 a(0.92%)。结论广州地区抗-HCV阳性的无偿献血人群HCV RNA阳性率男性高于女性,HCV毒株以1b和6 a亚型最多见。

HCV基因组NS1区的分子克隆及序列测定

对广东省一名慢性丙型肝炎病人血清中的ＨＣＶ基因组ＮＳ１区进行分子克隆及序列测定。采用微粒吸附法提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录后进行聚合酶链反应。所用引物位于ＮＳ１区，扩增产物７８０ｂｐ在低熔点琼脂糖中电泳，回收相应条带处凝胶，与ｐＵＣ１８的连接反应直接在低熔点琼脂糖中完成。重组体转化ＪＭ１０９，挑取菌落增殖后提取的质粒采用ＰＣＲ和酶切法鉴定阳性克隆。将其中３２０ｂｐ的片段亚克隆ｐＵＣ１８和ｐＵＣ１９，随后采用双脱氧链末端终止法测其核苷酸序列，与国内外多个株比较，同源性介乎６８．８６％—９０．８４％。

HCVE＿2／NS＿1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５’非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基围亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，在ＨＣＶ－Ｓ１片段的３’端有一３６个核苷酸的区域。

中国地区HCV株包膜区cDNA序列变异性分析

目的 研究国内不同地区ＨＣＶ包膜基因区变异。方法 对国内不同地区慢性丙型肝炎患者的１３株 ＨＣＶ采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增ＨＣＶ包膜基因区（Ｅ１、 Ｅ２／ＮＳ１）片段，对其中的１００５ｂｐ的ｃＤＮＡ进行测序，并与 国内外株进行变异性分析。结果 国内ＨＣＶ株比较，同型（Ⅱ）间该区核苷酸和氨基酸的同源性分别介于７６．４２％～ ９７．１１％和７５．２２％～９３．１５％，不同型（Ⅲ）间分别为６２．２９％～６３．３８％和５１，２９％～６０．００％；国内与国际同型株比较，同型 （Ⅱ）间分别为７３．７３％～８７．７６％和７５．８２％～８８．０９５％，不同型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）间分别为６１．４９％～８１．４９％和４９．３５％～７８．２１％；国 内外１８株ＨＣＶ的ＨＶＲ１区同源性仅为３６．１１％～７５、３１％和２０．８０％～６２．９６％，发现两个新的较高变异区（第２５０～２５７ 位和第４４３～４６５位氨基酸）。结论 ＨＣＶ包膜区序列分析同型间同源性较高，异型间同源性较低；南北地区有差 异，国内外差异更大；最大的变异在ＨＶＲ１，并发现两个新的较高变异区。

中国人丙型肝炎病毒囊膜蛋白2HVR_1 cDNA的序列分析

目的：了解中国ＨＣＶ流行株高变区１（ＨＶＲ１）的特点。方法：对来自山东（ＳＤ）、上海（ＳＨ）两地患者血清ＲＮＡ进行逆转录－巢式ＰＣＲ，扩增ＨＣＶ囊膜蛋白２基因片段，用ＰＣＲ直接测序法对该片段进行序列测定。结果：（１）扩增片段（命名为Ｐ３８８）对应于日本ＨＣＶ－Ｊ株序列核苷酸１４３９～１８２６位（氨基酸位３７１～４９８）；（２）中国人ＨＣＶＨＶＲ１位于氨基酸位３８４～４１０，与发表的ＨＣＶＩＩ型ＨＶＲ１的氨基酸位点相同；（３）与ＨＣＶ－Ｊ、美国ＨＣＶ－１及已发表的中国河北、上海株相比，ＳＤ、ＳＨ株Ｐ３８８片段与ＨＣＶ－１株的核苷酸及氨基酸的异源性最高，比较各株ＨＶＲ１核苷酸序列也与上述结果一致；（４）ＨＶＲ１基因有义突变率相当高。结论：中国ＨＣＶ流行株存在ＨＶＲ１，其基因变异程度及有义突变率高，对研究ＨＣＶ感染及进行免疫预防有重要的意义。

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

Complementary DNA of partial HCV NS2 NS3 protein gene which encodes viral Zn 2+ dependent metalloprotease and serine protease was amplified by RT nested PCR from serum of a Chinese patient with chronic hepatitis C.The product was digested with Eco R Ⅰ/ Xba Ⅰ and cloned into pcDNA3.The nucleotide sequence was determined.Comparison of NS2 NS3 with the reported typical isolates HCV 1,HCV J,HC C2,HCV J6,HCV J8 showed as 73.72%,90.20%,91.02%,64.56%,63.37% identity in nucleotide sequence and 83.24%,92.09%,93.13%, 70.88% ,67.86% identity in amino acid sequence respectively, so the isolate could be classified as HCV genotype Ⅱ. This gene fragment was cloned into pBV220 to construct recombinant expression vector pBV220 NS2 3.It was expressed efficiently in E.coli . The cloning and expression of HCV NS2 NS3 may contribute to the investigation of the relation between structure and function of viral encoded protease.

丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达及其核苷酸序列分析

以基因扩增及重组DNA技术，从长江下游南通地区急性丙肝和慢性丙肝患者血清中成功地克隆了丙肝病毒核心蛋白基因（HCV－Y1和HCV－Y2）。该段基因在大肠杆菌内已得到高效表达，它们的序列分析发现核苷酸组成的同源性为93．2％，与已报告的HCV株比较属于HCV－Ⅱ型。这对于我国HCV的基因分型以及开发丙肝核心蛋白抗体检测，早期诊断丙肝感染都具有良好的应用前景。

上海地区Ⅱ、Ⅲ型丙型肝炎病毒包膜区cDNA序列分析

目的 分析上海地区丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus ,HCV)Ⅱ、Ⅲ型包膜区cDNA序列变异。方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增HCV包膜区E1、E2 /NS1片断 (10 0 5bp) ,在373DNA全自动测序仪上进行了序列分析。结果 HCV E1、E2 /NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示 :上海株Ⅱ型、Ⅲ型间同源性分别为 6 2 .48%和 5 9.10 % ;上海株与国内外同型株间分别为85 .97%～ 87.36 %和 83.38%～ 86 .5 7% ;上海株与国内外不同型株间分别为 6 1.49%～ 70 .95 %和5 9 .10 %～ 78.2 1%。此外 ,共发现 5个变异较大的区域 ,其中两个是国际公认的高变区 (HVR1及HVR2 ) ,另外 3个为首次报道 (第 2 5 1～ 2 5 8、2 97～ 30 1、46 1～ 46 7位氨基酸 )。结论 HCV E1、E2 /NS1序列变异大 。

丙型肝炎病毒非结构区抗原制备及其相应抗体的检测

目的 研究丙型肝炎病毒非结构区 3(HepatitisCvirusnonstructurdregion 3,HCV NS3)与丙型肝炎发病的关系 ,寻求一种可用于判断临床干扰素 (Interferon ,IFN)治疗疗效的检测方法。方法 采用基因重组 ,经大肠埃希菌表达 ,提取HCV NS3不同末端蛋白作为抗原 ,并回顾性的对IFN治疗的 6 3例HCV RNA阳性的丙型肝炎患者血清用免疫印迹 (Westernblot)方法 ,进行了相应抗体检测。结果 证实HCV NS3不同末端抗体在丙型肝炎患者 ,特别是慢性丙型肝炎患者 ,与IFN治疗疗效关系密切。结论 通过测定HCV NS3不同末端抗体的方法有可能对丙型肝炎 ,特别是慢性丙型肝炎患者的IFN治疗效果进行评价 ,为预测疗效提供了一个新的手段和依据。

大理地区丙型肝炎病毒NS5基因基础上的分型研究

对大理地区2014年流行的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的非结构蛋白5(Nonstructural protein 5,NS5)基因序列进行分析研究,以了解云南省大理地区流行的HCV基因型或基因亚型。2014年1～10月在大理州人民医院收集临床诊断丙型肝炎病人血清,共收集到血清48份;对这些标本进行病毒核酸提取和反转录合成cDNA,采用HCV NS5基因特异引物进行RT-PCR扩增,27份标本扩增阳性,序列分析结果显示:5株与基因3a型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在90.8%～98.3%之间;14株与基因3b型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在87.5%～98.6%之间;5株与基因1b型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在91%～97.7%之间;3株与基因6n型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在92.8%～96.5%之间,表明本次分离到的27株HCV病毒中,5株属于3a型,14株属于3b型,5株属于1b型,3株属于6n型等3个基因型4个基因亚型。以上研究提示大理地区至少存在1b、3a、3b和6n基因亚型HCV流行,但以基因3型(3a、3b)为主要流行HCV基因型或基因亚型。