丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶基因克隆与原核表达

丙型肝炎病毒 (HCV)依赖于RNA的RNA聚合酶 (RdRp)是参与病毒基因组RNA复制的一个关键蛋白因子 ,是研究抗HCV新型药物的重要靶标 ,获得纯化的RdRp产物是建立靶向RdRp药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤。以HCV病毒基因组全长cDNA质粒 (p90 HCVFL longpU)为模板 ,设计了特异性扩增RdRp的引物 ,通过CPR扩增获得编码RdRp的基因。将该基因克隆到T载体中 ,构建了重组质粒 ,通过克隆快速筛选和酶切分析筛选到含RdRp基因的阳性克隆(克隆号为 4 4 ) ,DNA序列分析证实 4 4号阳性克隆RdRp基因序列与cDNA质粒中的相应序列完全一致。将含RdRp基因的重组质粒 (44号 )用NheⅠ XhoⅠ双酶切 ,获得RdRp基因 ,将该基因连接到用NheⅠ XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET2 8(a)中 ,构建了重组质粒pET2 8(a) NS5B ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经 1mmol LIPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ,发现一条特异性蛋白带 ,相对分子质量约 6 6× 10 3 ,与预期的完全一致。HCVRdRp基因的克隆与表达为靶向RdRp的新型抗HCV药物研究 。

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCV C端截短21个氨基酸的NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件。利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a(+)-NS5B-C21,IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pET-28a(+)-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5B-C21表达产物的可溶性明显增加。HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础。

HCV 1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a/1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Western blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV)1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCVNS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制。HCV 5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合。3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入“TT”和“AAT”可不影响RORp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义。

丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶在大肠杆菌中可溶性表达条件的优化

为了提高丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(HCV-RdRp)在大肠杆菌中的可溶性表达,对影响蛋白可溶性表达水平的多种因素进行了优化。探讨了诱导时机、诱导温度及时间、诱导剂IPTG浓度等对重组蛋白可溶性表达的影响,筛选出了提高可溶表达该蛋白的最适条件。结果表明,在菌体密度OD600约为1.6时,加入终浓度为0.20 mmol/L的诱导剂IPTG,25℃下诱导表达16 h,可以获得最多的可溶性表达蛋白,获得了纯化较好并有特异性的HCV-RdRp重组蛋白,为建立其体外活性测定方法及抑制剂的筛选奠定了基础。