人胰岛素样生长因子Ⅰ型在E.coli和家蚕中的表达

将hIGF-I基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),在E.coli中进行了融合表达,West-ern blotting显示在26 kD附近有一条特异条带。将hIGF-I基因克隆进pBacPAK-8,获得了杆状病毒转移载体pBacPAK-8-IGF-I,在脂质体的介导下,与线性化的家蚕杆状病毒共转染家蚕培养细胞Bm-N,经空斑筛选,PCR检测,获得了重组病毒Bm-Bac-hIGF-Ⅰ。SDS-PAGE检测表明,在感染重组病毒后,家蚕幼虫血淋巴中可以检测到一条分子量约为7.5 kD的特异性条带,ELISA检测表达量达4.51μg/mL蚕血淋巴。

重组人肝细胞生长因子α高效表达工程菌筛选及发酵工艺研究

将人肝细胞生长因子α重组质粒转化至不同E.coli菌株,在相同培养条件下比较其表达量,筛选高表达工程菌株;在15L的发酵罐内,采用分批补料培养的方法,研究表达菌株的发酵培养条件,检测改变发酵培养基成分、种子液接种量、诱导时间等参数对菌液密度以及蛋白表达的影响,同时检测质粒传代的稳定性。实验结果表明筛选出的高表达工程菌在优化的发酵培养条件下,菌体收获量可达52g/L,目的蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的25%,且质粒和蛋白表达均具有良好的稳定性。高效表达工程菌和优化发酵工艺可以较好地提高菌体收率,为规模化生产奠定了基础。

基因工程牛生长激素高密度发酵表达的研究

通过对重组牛生长激素基因工程大肠杆菌摇瓶和5、30 L发酵罐发酵表达的研究,建立了基因工程牛生长激素的高密度发酵表达工艺,菌体密度最高可达到OD550=120,rbIL-2的表达量占菌体总蛋白的20%以上。

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点，组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体，使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达，另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的 实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法 首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果 菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论 本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。

重组人肝细胞生长因子重链在大肠杆菌中的表达研究

目的 观察经过转录前加工、修饰后克隆至表达载体pBV2 2 0中的人肝细胞生长因子α链cDNA在大肠杆菌的表达情况 ,优化表达条件 ,以建立hHGFα原核高效表达体系 ,并进一步研究hHGF -α蛋白的生物学功能。方法与结果 将重组表达质粒pBV2 2 0 hHGF α转化大肠杆菌DH5α、Plyss ,通过升温诱导法 ,即将温度由 30℃升高到 42℃ ,诱导外源基因表达。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hHGF α蛋白表达 ,电泳图谱显示一特异的分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带。SDS PAGE光密度扫描对外源基因表达产物进行初步定量 ,表达产物分别占细菌可溶性蛋白总量的 2 5 %、30 %。进一步行West ern blot对表达产物进行定性 ,外源基因表达蛋白与特异的hHGF α抗体呈阳性反应。结论 成功地建立了hHGF

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。