RNA干扰胰岛素生长因子-1受体基因对人肝癌SMMC7721增殖及凋亡蛋白的影响

目的观察RNA干扰胰岛素生长因子-1(IGF-1)受体基因后对人肝癌细胞株SMMC7721增殖和相关凋亡因子表达的影响。方法构建两个靶向IGF-1R基因的RNA干扰真核表达质粒(IGF-1R-siRNA-1和IGF-1R-siRNA-2)分别转染至SMMC7721细胞,并设立正常对照组、空白对照组、IGF-1R-siRNA-1转染组、IGF-1R-siRNA-2转染组。采用聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot检测IGF-1R基因表达变化,检测细胞增殖、侵袭、凋亡、凋亡蛋白、骨形态发生蛋白(BMPs)及相关信号通路蛋白的表达水平。结果RT-PCR结果显示,IGF-1R-siRNA-1和IGF-1R-siRNA-2表达载体转染SMMC-7721细胞后,IGF-1R基因的mRNA水平显著下调,IGF-1R-siRNA-1转染组IGF-1R基因的表达低于正常对照组,IGF-1R-siRNA-2转染组IGF-1R基因表达下调77.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,IGF-1R-siRNA-1转染组和IGF-1R-siRNA-2转染组IGF-1R蛋白在不同水平显著下调,IGF-1R蛋白表达抑制率分别为73.0%和81.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。IGF-1R-siRNA-1转染组和IGF-1R-siRNA-2转染组细胞增殖率明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ImageJ软件分析划痕面积结果显示,与正常对照组和空白对照组相比,IGF-1R-siRNA-1转染组、IGF-1R-siRNA-2转染组修复率下降,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验发现,与正常对照组和空白对照组相比,IGF-1R-siRNA-1转染组、IGF-1R-siRNA-2转染组为SMMC-7721细胞侵袭能力明显下降,侵袭细胞数量明显减少,差异有统计意义(P<0.05)。流式细胞检测显示,IGF-1R-siRNA-1转染组和IGF-1R-siRNA-2转染组晚期凋亡率明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,IGF-1R-siRNA-1组、IGF-1R-siRNA-2组Bcl-2表达均明显受抑制,Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达量明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PI3K、AKT/p-AKT、BMP-2、BMP-7蛋白表达量明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论由IGF-1R基因沉默对肝癌SMMC7721细胞增殖与侵袭有抑制作用,对细胞凋亡有促进作用,能介导BMP2、BMP-7基因不同水平下调,IGF-1/PI3K/AKT信号通路蛋白可能参与其中。

蛇床子素诱导内质网应激抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的机制研究

目的研究蛇床子素抑制肝癌细胞增殖的机制。方法采用20-100μM蛇床子素干预SMMC7721人肝癌细胞24 h、48 h和72 h,运用MTT方法检测细胞增殖;采用20-80μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞24 h,运用流式细胞术检测细胞凋亡及Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达;采用60μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞48 h,运用流式细胞术检测细胞周期,以实时荧光定量PCR技术检测GRP78、DDIT3、GADD34、ATF4、EIF2A、GDF15、CDKN1B、FOXO3、RICTOR、SGK1基因表达,Western blot方法检测CyclinD1、CyclinE1、p27Kip1和CDK4细胞周期蛋白及GRP78、GRP94、PERK、XBP-1s、CHOP、peIF2α(Ser51)内质网应激蛋白表达。各实验均以0.1%DMSO为对照组,并以0.1μM毒胡萝卜素为内质网应激诱导剂组。结果与对照组比较,100μM蛇床子素干预24 h显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖,其抑制率为36.76%(P<0.05);60-100μM蛇床子素干预48 h后显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖,抑制率为30.84%-52.49%(P<0.05);40-100μM蛇床子素干预72 h后显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖,抑制率为32.7%-73.15%(P<0.05)。大于60μM蛇床子素可诱导SMMC7721肝癌细胞晚期凋亡且显著抑制促凋亡蛋白Bax表达(P<0.05)。60μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞48 h后,G1期细胞数增加、G2期和S期减少,且CyclinD1、CyclinE1和p27Kip1蛋白表达显著被抑制(P<0.05)。20-80μM蛇床子素处理SMMC7721肝癌细胞24 h后,均显著促进GRP78、DDIT3(CHOP)、ATF4、FOXO3、RICTOR和SGK1基因表达(P<0.05);20μM蛇床子素显著促进GADD34和EIF2A基因表达(P<0.05);80μM蛇床子素显著促进GDF15基因表达(P<0.05),且CHOP、XBP-1s蛋白表达显著增强。结论蛇床子素通过诱导内质网应激反应以抑制SMMC7721肝癌细胞增殖,从而发挥抗肝癌活性。

三种中草药对人肝癌细胞SMMC7721体外增殖抑制

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和细胞凋亡形态观察,初步探讨白英、毛麝香和使君子3种中草药的醇提物对肝癌细胞SMMC7721体外增殖的抑制效果.结果表明,白英醇提物对肝癌细胞SMMC7721有很强的抑制作用,当抑制率为50%时,样品的质量浓度(5ρ0)达到25.85 mg.L-1,且经50 mg.L-1作用72 h后,细胞逐渐变圆,体积缩小,有凋亡小体形成,呈典型的凋亡现象;使君子、毛麝香的醇提物对细胞抑制作用较弱,在药物质量浓度达到100 mg.L-1时,对SMMC7721细胞的抑制率分别为43.88%,20.88%,二者的5ρ0均大于100 mg.L-1.

预知子、白花蛇舌草抑制肝癌细胞恶性增殖的研究

目的:在中医药常用治法方药中筛选最具抑制肝癌细胞恶性增殖的药物。方法:采用MTT法和细胞形态学检查,观察中药行气活血方、清热解毒方及其各组成药物乙醇提取物及联合细胞毒抗生素G418对肝癌细胞恶性增殖的抑制作用。结果:清热解毒方及各单味药物对肝癌细胞恶性增殖均具有不同程度的抑制作用,存在量效关系;其中5mg/ml白花蛇舌草对肝癌细胞的增殖抑制作用最强(P<0.05)。行气活血方及各单味药物对肝癌细胞恶性增殖也多具不同程度的抑制作用,存在量效关系;其中5mg/mL预知子的作用尤为突出,强于阳性对照G418 0.6 mg/mL(P<0.01)。2.5mg/mL预知子联合0.3 mg/mL G418用药,其对肝癌细胞恶性增殖的抑制作用接近0.6 mg/mL G418,提示有减量增效作用。无论是单独用药还是联合G418,预知子对肝癌细胞恶性增殖的抑制作用均显著于白花蛇舌草(P<0.01)。结论:预知子、白花蛇舌草是抑癌扶正行气活血方中抑制肝癌细胞恶性增殖的主要药物,其中预知子的作用最显著。预知子联合细胞毒抗生素,具有减少细胞毒抗生素用量且增效的作用。

不同中药体外不同给药对人肝癌细胞恶性增殖的影响实验

目的:观察肝癌治疗清热解毒方、行气活血方水提取物及大鼠含药血清细胞给药对人肝癌SMMC7721细胞恶性增殖的影响与差异。方法:常规方法制备清热解毒方和行气活血方水提取物(2.0 g生药/mL),及其大鼠含药血清;采用MTT法观察不同中药体外不同给药对人肝癌SMMC7721细胞恶性增殖的影响。结果:与正常细胞(3 d)相比,清热解毒方或行气活血方水提取物对人肝癌SMMC7721细胞恶性增殖均具有抑制作用(P<0.01),存在量效关系。与正常细胞(3 d)相比,清热解毒方或行气活血方含药血清对人肝癌SMMC7721细胞恶性增殖亦均具有抑制作用(P<0.01),存在量效关系的趋势。行气活血方直接给药的药效较其含药血清更显著。结论:清热解毒方与行气活血方对人肝癌SMMC7721细胞的恶性增殖均具有抑制作用;行气活血方含药血清的药效较直接给药有下降趋势。

p[5HRE]AFPp-p53/PEI-Fe_3O_4磁性纳米颗粒联合磁流体热疗对肝癌细胞的抑制作用

目的:建立p[5HRE]AFPp-p53/PEI-Fe_3O_4磁性纳米颗粒靶向基因治疗和磁流体热疗系统用于肝癌的联合治疗,以提高治疗的安全性和有效性。方法:亚克隆基因重组法构建靶向肝癌的治疗基因p[5HRE]AFPp-p53,并用限制性内切酶凝胶电泳法检测重组质粒是否构建成功;用共沉淀法制备磁性纳米颗粒PEI-Fe_3O_4,利用透射电镜、粒径仪、傅里叶转换红外光谱仪等对PEI-Fe_3O_4进行表征检测。MTT法检测PEI-Fe_3O_4转染p[HRE]AFPp-p53至不同细胞系后的细胞增殖及磁流体热疗和基因治疗联合作用对肝癌细胞Hep G2的增值抑制作用。结果:成功制备载有靶向治疗基因的p[5HRE]AFPp-p53/PEI-Fe_3O_4磁性纳米颗粒,由其介导的基因治疗组与阴性及纳米颗粒对照组相比,明显抑制肝癌Hep G2(AFP阳性)细胞[(0.592±0.041)vs(1.052±0.031)、(1.012±0.021),P<0.01]和SMMC7721(AFP阴性)细胞(0.813±0.042)vs(1.073±0.032)、(1.182±0.052),P<0.01]的增殖活性,但对非肝癌细胞(L929和Lovo)增殖抑制作用无明显影响(P>0.05)。基因治疗和磁流体热疗联合组与单独使用热疗组及基因治疗组相比显著增加Hep G2细胞的增殖抑制率(76.11%vs 35.22%、42.92%,均P<0.01)。结论:p[5HRE]AFPp-p53/PEI-Fe_3O_4磁性纳米颗粒对肝癌细胞具有特异性杀伤作用,并且能与磁流体热疗产生协同效应,是一种选择性高、治疗效果好的肿瘤治疗方法。

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达。方法以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中。采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达。结果PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功。在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达。

新城疫病毒HN基因诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用机制

目的探索含新城疫病毒(NDV)HN基因的质粒pVHN诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用及其机制。方法以脂质体介导方法在体外转染pVHN于SMMC7721细胞24h后,通过MTT方法检测细胞活性状态;采用流式细胞仪(FCM)检测法,通过碘化丙啶(PI)染色测定细胞死亡率;以罗丹明123染色测定线粒体跨膜电位(△Ψ)的改变;提取细胞基因组DNA进行电泳,检测DNA有无断裂;用底物颜色反应检测Caspase3活性。结果细胞SMMC7721在体外转染pVHN后,死亡率达50.0%(转染空载体质粒对照组为5.2%);细胞基因组DNA呈梯状谱带;线粒体△Ψ下降,Caspase3活性明显升高。结论新城疫病毒HN基因在体外转染细胞SMMC7721,能明显诱导细胞SMMC7721凋亡,其发生机制可能是由于HN基因的导入引起线粒体△Ψ下降,进而激活Caspase3使细胞凋亡。

肝癌全方及其不同治法拆方抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的作用

目的：探讨肝癌全方及不同治法拆方抗肿瘤作用的分子机制。方法：体外培养SMMC7721人肝癌细胞,分别给予2.5-100 g·L-1肝癌全方、清热方、活血方、健脾方干预24 h后,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖;分别采用1.25-20 g·L-1肝癌全方,5-20 g·L-1清热方和活血方及20-120 g·L-1健脾方干预24 h后,运用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测相关基因的表达;分别采用20 g·L-1肝癌全方和清热方,10 g·L-1活血方及120 g·L-1健脾方干预SMMC7721细胞24 h后,通过蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达,通过碘化丙啶（PI）/RNase staining solution试剂染色检测细胞周期的改变。结果：与空白组比较,肝癌全方及其不同治法拆方能抑制SMMC7721细胞的增殖,并呈现量效关系（P〈0.05）。与空白组比较,5-20 g·L-1清热方呈现量效抑制细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B（CDKN1B）基因表达（P〈0.05）,20-120 g·L-1健脾方也呈现量效抑制CDKN1B基因表达（P〈0.05）;5-20 g·L-1肝癌全方明显抑制糖皮质激素调节蛋白激酶1（SGK1）基因表达（P〈0.05）,且量效显著;5-20 g·L-1清热方量效抑制SGK1基因表达（P〈0.05）;20-120 g·L-1健脾方也抑制SGK1基因表达（P〈0.05）,同时肝癌全方及清热、活血治法方可抑制SGK1磷酸化蛋白的表达（P〈0.05）;1.25,20 g·L-1肝癌全方可促进叉头框蛋白O3（FOXO3）基因表达（P〈0.05）;15,20 g·L-1清热方明显促进FOXO3基因表达（P〈0.05）;20 g·L-1活血方促进FOXO3基因表达（P〈0.05）。与空白组比较,全方组G2期细胞数增加（P〈0.05）,清热组和健脾组G2期细胞数增加更明显（P〈0.05）;肝癌全方及不同治法拆方能够抑制细胞周期蛋白E1（Cyclin E1）蛋白的表达,其中以健脾组抑制效果最显著。结论：肝癌全方及其不同治法拆方通过改变细胞增殖和周期,从而发挥抑制肝癌的作用。

复方苦参注射液对人肝癌SMMC7721细胞增殖的抑制作用

目的:研究复方苦参注射液对人肝癌SMMC7721细胞增殖的抑制作用。方法:体外传代培养SMMC7721细胞。10、20、40、80、160μl/ml复方苦参注射液培养细胞24、48、72 h后,采用MTT法测定细胞活力并计算抑制率。0(阴性对照)、10、20、40、80、160μl/ml复方苦参注射液培养细胞48 h后采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,并分析细胞周期分布百分比。结果:10、20、40、80、160μl/ml复方苦参注射液培养细胞24、48、72 h对细胞具有明显的抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。与阴性对照比较,40、80、160μl/ml复方苦参注射液培养细胞48 h后,G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.05),S期细胞比例明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论:复方苦参注射液对SMMC7721细胞的增殖具有抑制作用,其机制可能是诱导细胞凋亡、阻滞细胞于G0/G1期。