柳树叶提取物诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡的实验研究

目的:研究柳树叶水提物抗肿瘤作用,为最终提取一种有效抗肿瘤药物及临床前实验提供依据。方法:柳树叶水提物制备药物血清作用于培养的肝癌细胞株hep-G2,检测其凋亡。采用端粒重复序列扩增(TRAP)法结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测端粒酶活性。结果:柳树叶水提物制备药物血清对靶细胞有明显的抑制生长现象。孵育一段时间后,能使肝癌细胞发生凋亡,并呈现对浓度的依懒性和伴随端粒酶活性下降。结论:柳树叶提取物能诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡。

沉默IGF1和EGF二受体基因的肝癌HepG2细胞株的抗瘤放疗增敏及机制

目的探讨同时沉默IGF1与EGF二受体基因的抗瘤放疗增敏以及其病理机制。方法按照特定的方式创造出靶向EGFR、IGF1R以及两受体的小分子干扰RNA,并在一定的条件下设定出同所有基因不产生同源的阴性对照质粒,对其进行转染超过48 h之后选择使用射线对肝癌Hep G2细胞株进行照射。在成克隆的研究过程中对细胞的存活分数进行检测,选择使用单击多靶模型与线性二次函数模型两种方式共同制定出细胞存活曲线,进而获取放射生物学参数DO、Dq、N以及α、β、SF2的数值。结果将两个组之间进行对比我们可了解到,其明显控制了细胞增殖以及起到诱导细胞死亡的作用,减缓G1/S期的发展过程,bcl-2与cdk2两者之间呈现出明显的下降趋势,p21与bax则呈上升趋势。并且同时沉默EGFR与IGF1R组与对照组细胞的D0数值则是0.588与2.070 4 Gy;Dq的数值则是0.562 5与2.030 7 Gy;a值则是0.515与0.021 6 Gy-1;SF2值则是0.22与0.619。这一组的DO、Dq以及SF2值全部呈下降趋势,α值则呈上升趋势。结论同时沉默EGFR与IGF1R基因对于肝癌Hep G2细胞株增殖以及死亡起到干扰的效果,并且病理机制也同bcl-2与cdk2等有着直接的联系,结合多种方法对此疾病进行治疗是目前发展前景比较广阔的方式,可在临床上进行推广及使用。

银杏酚对顺铂化疗Heps肝癌小鼠血清干扰素-γ、白介素-2和肿瘤坏死因子-α水平的影响

目的:探讨银杏酚对顺铂化疗Heps荷瘤小鼠的抑瘤作用及对血清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响。方法:建立小鼠肝癌Heps移植瘤模型后,将雌雄各15只荷Heps肝癌移植瘤小鼠随机分为生理盐水组、顺铂组(3.75 mg/kg)、银杏酚组(40 mg/kg)、顺铂(3.75 mg/kg)+低剂量(20 mg/kg)银杏酚组、顺铂(3.75 mg/kg)+高剂量(40 mg/kg)银杏酚组。观察各组小鼠一般状况,检测体质量变化,抑瘤率及脾脏、胸腺、肝脏的器官指数;ELISA检测血清IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平。结果:与顺铂组相比,顺铂+高剂量银杏酚组不仅能明显提高小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数(P<0.05),还能显著升高血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平(P<0.05)。结论:40 mg/kg银杏酚对顺铂具有增效作用,并改善顺铂对化疗小鼠免疫功能的抑制作用,通过调节免疫功能来增强顺铂的抗肿瘤能力。

腺病毒介导的BIRC5-shRNA增强索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的研究BIRC5靶向基因治疗联合索拉非尼分子靶向治疗肝癌的协同效应以及对肝癌细胞凋亡的诱导作用。方法构建BIRC5特异性小发卡RNA的腺病毒AdEGFP-shBIRC5,用免疫细胞化学染色法检测其对BIRC5的沉默作用。建立肝癌移植瘤模型验证AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼治疗的疗效,采用免疫组化染色法鉴定AdEGFP-shBIRC5对癌细胞BIRC5基因表达的抑制作用;TUNEL法标记AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡。结果腺病毒介导的BIRC5-shRNA表达能有效沉默肝癌细胞BIRC5表达,AdEGFP-shCtrl对照组的BIRC5阳性表达率为(78.8±12.6)%,AdEG-FP-shBIRC5实验组为(20.6±8.2)%,两组差异有统计学意义(P<0.01)。Hep3B裸鼠移植瘤治疗后5周,与空白对照组相比,AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼组、单用AdEGFP-shBIRC5组、单用索拉非尼组的抑瘤率分别为61.78%(P=0.0032)、42.36%(P=0.0059)和29.20%(P=0.0169);与此对应,AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼组与单用索拉非尼组相比,肝癌细胞BIRC5表达被抑制(P=0.0364),细胞凋亡比例明显升高(P=0.0296)。结论针对BIRC5的基因治疗能提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性,显著诱导癌细胞凋亡。

miR-26a对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响及初步机制的研究

目的:探讨miR-26a对人肝癌细胞株Hep G2侵袭迁移能力的影响及可能机制。方法:将miR-26a表达质粒及对照质粒分别转染Hep G2细胞,qRT-PCR检测转染后miR-26a的表达,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测Hep G2细胞迁移和侵袭能力的改变,qRT-PCR和Western blot检测转染后AEG-1 mRNA和蛋白的表达。结果:转染miR-26a表达质粒后,Hep G2细胞miR-26a表达明显增高(P<0.01),迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05),AEG-1 mRNA及蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。结论:过表达miR-26a,可抑制Hep G2细胞迁移和侵袭,其机制可能与抑制AEG-1表达相关。

单叶蔓荆果实中多甲氧基黄酮类成分的分离、鉴定及细胞毒活性分析

单叶蔓荆（Vitex rotundifolia Linn.f.）为马鞭草科（Verbenaceae）牡荆属（Vitex Linn.）多年生落叶灌木,其干燥成熟果实供药用,具有疏散风热的功效[1]。单叶蔓荆生于沙滩、海边及湖畔,主要产于中国安徽、福建、广东、河北、江苏、江西、辽宁、山东、台湾和浙江等地,日本、东南亚地区和太平洋群岛也有分布[2]。

吴茱萸碱对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨吴茱萸碱(EVO)对人肝癌Hep G2细胞增殖的影响及作用机制。方法以人肝癌细胞株(Hep G2细胞)为受试细胞,实验设对照组、吴茱萸碱5.0、12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L组,采用噻唑蓝法检测Hep G2细胞增殖抑制率,划痕实验检测Hep G2细胞伤痕愈合率,Western blot检测Hep G2细胞基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白。结果吴茱萸碱对Hep G2细胞增殖抑制率明显高于对照组,呈现时间-剂量依赖关系(P<0.05);与对照组比较,吴茱萸碱5.0、25.0、50.0μmol/L组Hep G2细胞24、48 h伤痕愈合率[分别为(23.31±1.03)%、(10.37±1.06)%、(7.92±1.40)%和(13.86±5.57)%、(1.78±3.08)%、0%]明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,吴茱萸碱5.0、25.0、50.0μmol/L组Hep G2细胞24 h MMP-9、PCNA蛋白表达量[分别为(0.53±0.020)、(0.35±0.020)、(0.21±0.015)与(0.76±0.032)、(0.66±0.01)、(0.59±0.015)]降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论吴茱萸碱可明显抑制Hep G2细胞增殖及远处迁徙,其机制可能与吴茱萸碱下调MMP-9、PCNA蛋白有关。

竹节香附素A对人肝癌HepG_2细胞VEGF基因表达的影响

目的观察竹节香附素A对人肝癌细胞株HepG_2细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养HepG_2细胞,将不同浓度的竹节香附素A与HepG_2细胞共培养,采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测不同浓度竹节香附素A处理HepG_2细胞24 h后细胞培养上清液中VEGF蛋白含量的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测竹节香附素A对HepG_2细胞VEGF mRNA和蛋白相对表达水平(阳性条带灰度值/β-actin带灰度值)的影响。结果 (1)不同浓度(5、10、20μg/ml)竹节香附素A处理HepG_2细胞24 h后,细胞培养上清液中VEGF水平呈剂量依赖性降低(P=0.000)。(2)竹节香附素A对HepG_2细胞VEGF mRNA表达的影响:(1)不同浓度竹节香附素A(0、5、10、20μg/ml)处理HepG_2细胞24 h后,VEGF mRNA的相对表达量呈剂量依赖性减少(0.96±0.07、0.75±0.09、0.55±0.10、0.32±0.11,P=0.000)。(2)10μg/ml竹节香附素A分别处理HepG_2细胞0、6、12、24 h后,VEGF mRNA的相对表达水平呈时间依赖性下降(0.77±0.05、0.53±0.09、0.32±0.12、0.15±0.04,P=0.000)。(3)竹节香附素A抑制HepG_2细胞VEGF蛋白的表达:(1)不同浓度竹节香附素A(0、5、10、20μg/ml)处理HepG_2细胞24 h后,VEGF蛋白相对表达水平呈剂量依赖性下降(2.08±0.28、1.43±0.22、0.72±0.15、0.17±0.10,P=0.000)。(2)10μg/ml竹节香附素A分别处理HepG_2细胞0、6、12、24 h后VEGF蛋白相对表达水平呈时间依赖性减少(2.47±0.05、1.36±0.02、0.30±0.02、0.07±0.02,P=0.000)。结论竹节香附素A能够下调HepG_2细胞VEGF表达,这可能是其抑制肝癌细胞生长增殖的重要机制之一。

光动力学疗法的抑瘤作用和免疫效应的实验研究

目的探讨光动力学疗法(PDT)抑瘤效应的免疫机理,以及PDT联合肿瘤局部注射卡介苗(BCG)的治疗效果。方法建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只,随机分为对照组、PDT组、BCG组和联合组。观测各组移植瘤体积的变化。采用酶联免疫吸附实验(ELISA),测定各组荷瘤小鼠血清中白细胞介素(interleukin,IL)-1β的变化。结果 (1)各治疗组治疗后7 d的移植瘤体积较对照组均明显缩小(P<0.01)。联合组治疗后7 d的肿瘤体积较单纯PDT组明显缩小(P<0.05)。(2)ELISA结果显示,PDT组和联合组治疗后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量,均高于对照组和BCG组(P<0.01)。联合组治疗后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量,超过单纯PDT组(P<0.05)。结论结果显示PDT对强化荷瘤宿主免疫力有显著作用。使肝癌移植瘤体积明显缩小。PDT联合局部注射BCG的治疗方法的疗效优于单用PDT和单用BCG。

海藻玉壶汤对Hep3B肝癌裸鼠肝功能及CyclinD1、Bax蛋白表达的影响

目的:观察海藻玉壶汤对人肝癌移植瘤裸鼠的抗癌作用,以及对肝功能指标血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartic transaminase,AST)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞凋亡调控基Bax蛋白表达的影响。方法:30只BALB/c裸鼠皮下接种Hep3B细胞,建立肝癌异位移植瘤模型,分为模型组(9 g·L-1氯化钠溶液灌胃),阳性对照组(盐酸多柔比星腹腔注射),海藻玉壶汤高剂量组、中剂量组、低剂量组(海藻玉壶汤灌胃)。治疗21 d后,称量小鼠体质量,取肿瘤组织测瘤质量、常规HE染色;免疫组织化学检测肿瘤组织CyclinD1、Bax;生化分析仪检测血清ALT、AST。结果:各组小鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。海藻玉壶汤高剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组比较,移植瘤瘤质量较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色观察肿瘤组织病理学可见治疗组不同程度肿瘤细胞灶性坏死,胞核固缩深染。免疫组织化学可见海藻玉壶汤各组CyclinD1蛋白阳性表达下降(P<0.05),Bax蛋白阳性表达增强(P<0.05)。结论:海藻玉壶汤可剂量依赖性地抑制裸鼠Hep3B移植瘤生长,一定程度上保护肝功能,并通过影响细胞周期和凋亡发挥抗肿瘤作用。

光动力疗法及其联合注射卡介苗对小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用与免疫反应

目的探讨光动力疗法(PDT)联合肿瘤局部注射卡介苗(BCG)的局部免疫反应及抑瘤效应。方法建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只,随机分为对照组、PDT组、BCG组和PDT+BCG联合组。观测各组移植瘤体积的变化。以F4/80抗体为标记,采用免疫组化法计数肿瘤局部巨噬细胞(MΦ)数量。结果 1.各治疗组治疗后7 d的移植瘤体积较对照组均明显缩小(P<0.01)。联合组治疗后7 d的肿瘤体积较单纯PDT组明显缩小(P<0.05)。2.免疫组化染色结果显示,PDT组和联合组治疗后2、24 h和7 d肿瘤局部MΦ数量均明显高于对照组和BCG组(P<0.01)。上述时间点联合组肿瘤局部MΦ数量明显高于PDT组(P<0.05)。结论 PDT使小鼠肝癌移植瘤体积缩小,增强荷瘤宿主治疗局部的免疫力。PDT联合局部注射BCG的治疗方法的疗效优于单纯PDT和单纯BCG。

两种细胞建立肝细胞氧化损伤模型比较

目的比较过氧化氢诱导人肝癌细胞株（Hep G2）与正常肝细胞株（Chang liver）建立的肝细胞氧化应激损伤模型。方法用不同浓度过氧化氢诱导Hep G2细胞和Chang liver细胞氧化应激损伤,采用噻唑蓝法检测细胞生长抑制率;分光光度法测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性,以及肝细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）含量。结果作用时间在0.5~4 h时,在75~600μmol/L浓度范围内,过氧化氢可浓度和时间依赖性地抑制2种肝细胞增殖,促使细胞内AST、ALT和LDH向培养液中释放;细胞中SOD和GSH活性明显降低,MDA含量明显升高,表明2种肝细胞氧化损伤模型构建成功;选择300μmol/L H2O2作用4 h为致Hep G2和Chang liver细胞氧化应激损伤的最佳条件,结果显示,Hep G2和Chang liver细胞的生长抑制率分别为62%和76%,培养液中ALT、AST、LDH活性分别为（18.2±0.2）、（34.2±4.6）、（544.2±26.8）和（19.1±0.1）、（30.3±2.5）、（536.8±22.3）U/L,细胞中MDA含量分别为（7.8±0.9）和（8.6±1.1）nmol/mgprot。结论Hep G2与Chang liver细胞均可用于氧化应激细胞损伤模型的制备。