F12基因p.Gly175Cys和p.Gly542Ser复合杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症的家系分析

目的:分析1例遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系的临床表型和基因突变情况,并探讨其分子致病机制。方法:凝固法检测活化部分凝血活酶时间和FⅫ活性;ELISA方法检测FⅫ抗原;Sanger测序法测定F12基因所有外显子及侧翼序列;ClustalX-2.1-win、PROVEAN及Swiss-Pdb Viewer软件分析突变位点氨基酸的保守性、突变氨基酸是否为有害突变及该位点发生突变后对蛋白质结构的影响。结果:先证者活化部分凝血活酶时间延长为71.3 s,FⅫ活性和FⅫ抗原分别降低为5%和6%;其F12基因第7和14外显子分别存在c.580G>T和c.1681G>A杂合错义突变,导致p.Gly175Cys和p.Gly542Ser;先证者父亲携带p.Gly175Cys杂合错义突变;先证者母亲、弟弟和女儿携带p.Gly542Ser杂合错义突变。软件分析结果表明Gly175和Gly542均保守,p.Gly175Cys和p.Gly542Ser为有害突变,突变发生后相应位点会对蛋白质局部结构产生影响。结论:p.Gly175Cys和p.Gly542Ser复合杂合突变是先证者家系遗传性FⅫ缺陷症的分子发病机制,其中p.Gly175Cys为国际上首次发现的新突变。

不孕合并凝血因子Ⅺ、Ⅻ缺乏症病人行体外受精-胚胎移植后妊娠2例及文献复习

目的分析行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕病人合并凝血因子Ⅺ、Ⅻ缺乏症的临床表现、实验室检查及治疗。方法通过分析2020―2021年潍坊医学院附属医院生殖医学中心收治的2例不孕合并凝血因子Ⅺ、Ⅻ缺乏症病人的临床资料,结合文献复习进行回顾性分析。结果2例病人均无出血史及血液系统疾病史,既往无月经过多;实验室检查结果均为活化部分凝血酶原时间(APTT)延长,血浆凝血酶原时间(PT)正常,凝血酶时间(TT)正常,凝血因子Ⅺ、Ⅻ减少;1例病人在严密监测下未出现取卵术中、术后出血,1例病人预防性输注新鲜冷冻血浆(FFP)后未出现术中、术后出血;2例病人分娩前均未预防性输注FFP,分娩过程顺利,未发生产后出血。结论凝血因子Ⅺ、Ⅻ缺乏症病人自发性出血少见,无出血症状或出血轻微;APTT、PT、TT是该疾病的常规检查,凝血因子Ⅺ、Ⅻ活性与出血量无相关性,血栓动力学(TD)可对该疾病进行出血预测,目前缺乏大量前瞻性研究;术前充分评估可有效降低出血风险。

10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症分子发病机制与临床特性分析

目的 探讨 10例遗传性凝血因子Ⅶ (coagulationfactorⅦ ,FⅦ )缺陷症基因突变类型与临床特性。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、5’和 3’非翻译区进行分析 ,寻找基因突变 ;将含插入或缺失突变序列克隆入pMD18 TTA克隆载体中 ,对所得两条染色体相应序列分别测序 ,以确定突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析 ,无酶切位点改变的基因片段用等位基因特异的PCR(ASPCR)方法 ,证实测序所发现的突变。结果 在 10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中发现 8种类型的基因突变 ,其中 6 390T→C(Phe4 0Cys) ,94 82G→T(Arg15 2Leu) ,和 114 87 9delC 3种突变为国际首次报道 ;6种突变发生在催化区 ;除一种缺失突变外 ,其余均为点突变 ;所有的基因突变都来自先证者的父亲和 (或 )母亲。Thr35 9Met和Arg30 4Trp突变分别在 4个及 2个无亲缘关系的家系中重复出现。 2例Thr35 9Met纯合突变 (FⅦ :C分别为 2 %和 3% )及 1例Arg15 2Leu、114 87 9delC及Arg30 4Trp复合杂合突变 (FⅦ :C为 1% )临床表型为重型 ;2例双重杂合突变 (His348Gln和Thr35 9Met,Agr30 4Trp和Arg30 4Gln)临床表型分别为中型和无症状

一例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症患者表型诊断及基因分析

目的:对1例遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症患者及其家系成员进行表型诊断和基因分析,探讨其发病的分子机制。方法:检测先证者及其家系成员(共3代8人)的血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)、凝血因子Ⅺ促凝活性(FⅪ:C)及凝血因子Ⅺ抗原含量(FⅪ:Ag)等指标以明确诊断;聚合酶链式反应(PCR)扩增FⅪ基因的所有外显子和侧翼序列,扩增产物纯化后直接测序,发现突变位点则反向测序予以证实;用Py MOL Viewer1.5.x软件构建野生型和突变型FⅪ蛋白模型,比对分析寻找突变前后空间构象及分子间作用力的变化。结果:先证者和其弟弟APTT、FⅪ:C、FⅪ:Ag均明显异常,分别为78.4 s、2.0%、6.8%和62.1 s、4.5%、10.0%;其家系成员的FⅪ:C和FⅪ:Ag均发现有不同程度下降。基因分析发现先证者和其弟弟FⅪ基因第6号外显子的g.15410G>A杂合无义突变导致Trp228stop及第12号外显子的g.25471C>G杂合错义突变导致Cys482Trp;其父亲、姐姐、女儿、外甥女均为Trp228stop的杂合子,而母亲、侄子则为Cys482Trp的杂合子。模型分析显示Cys482Trp突变并未破坏氨基酸间的天然氢键联系,但使该位点氨基酸与267位氨基酸的空间位阻变大,从而使蛋白的结构发生变化。结论:该遗传性FⅪ缺陷症患者FⅪ基因的Trp228stop无义突变和Cys482Trp错义突变与血浆FⅪ:C及抗原水平降低有关。

遗传性凝血因子XIII缺陷症基因突变的检测

目的研究一例遗传性凝血因子XIII(FXIII)缺陷症家系的基因缺陷。方法采用PCR、核苷酸测序的方法对该家系先证者及其家属外周血白细胞基因组DNA的FXIIIA基因进行检测。结果先证者第72045位缺失两个核苷酸A,位于外显子5;先证者的父母及先证者的姐姐分别在DNA水平相同位点呈杂合缺失。结论这例遗传性凝血因子FXIII缺陷症是由于FXIIIA基因缺陷造成。

双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的:探讨一例遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ,FⅦ)缺陷症家系基因突变的类型。方法:检测凝血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析,寻找基因突变;将含突变序列克隆入pGEM T—easy质粒载体中,对所得两条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶MspⅠ对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析,证实测序所发现的突变。结果:先证者在8号外显子上有两种基因突变:11348位C→T突变和11349位G→A突变。pGEM T—easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区Arg(CGG)304Trp(TGG)和Arg(CGG)304Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为11349位G→A和11348位C→T杂合突变;先证者的弟弟FⅦ基因为正常野生型;其哥哥和3个子女均为杂合性突变。PCR辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论:先证者FⅦ基因突变为不同染色体同一编码区Arg304Trp和Arg304Gln双重杂合性突变,此种突变类型的组合尚属首例。

9例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的基因诊断与表型分析

目的探讨9例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者的基因突变类型与临床特征。方法采用一期法检测患者的FⅦ活性(FⅦ:C),用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其FⅦ抗原(FⅦ:Ag)水平,并抽提患者的外周血基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增FⅦ基因所有外显子及其侧翼序列,采用DNA直接测序进行基因分析。结果在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现10种基因突变,包括3种剪切位点突变和7种错义突变。1例患者为p.Tyr128(68)Cys纯合突变,其FⅦ:C为0.8%,FⅦ:Ag为2.5%,临床表型为反复重度出血;5例患者携带FⅦ基因双杂合突变,分别为p.Thr241(181)Asn和p.Gly406(346)Asn、IVS1a+5G>A和p.His408(348)Gln、IVS5-1G>A和p.His408(348)Gln、c.*64G>A合并p.Ile213(153)Asn、p.Cys389(329)Gly和p.His408(348)Gln的双杂合突变,其相应的FⅦ:C分别为1.2%、4.4%、1.0%、0.5%和1.2%,患者临床出血症状轻重不一;3例患者携带杂合突变,分别为p.Cys389(329)Gly、p.His408(348)Gln和p.Thr419(359)Met,其FⅦ:C分别为0.5%、8.3%和9.4%,第1位有出血史,后2位无明显出血。结论在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现了10种基因突变,其中p.Gly406(346)Asn、c.*64G>A、p.Ile213(153)Asn为新发现突变。p.His408(348)Gln突变较常见,而FⅦ:C与患者的临床表型间无相关性。

124例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者基因型与临床表型

目的探讨124例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者基因型、临床表型及二者间的关系。方法从PubMed、中国知网(CNKI)、维普中文科技期刊数据库、万方数据知识服务平台、中国生物医学文献数据库(CBM)搜集1981-2019年全部关于凝血因子Ⅶ缺陷症的文献,并筛选出符合标准的共计124例患者的临床资料进行回顾性分析。结果124例凝血因子Ⅶ缺陷症患者共有57种基因突变,高危出血基因型有Arg304Trp、Thr359Met、His408Gln、IVS5-1G>A、Arg277Cys、Arg152Leu、Tyr128Cys、Arg364Gln、27/28delCT、11520/11521insT、11487-9CCCdelC、26/27delTC;在纯合子患者中,出现中枢神经系统出血的是IVS5-1G>A、IVS6-1G>A基因型者;出现消化道出血的是IVS5-1G>A、Thr359Met、27/28delCT基因型者;出现关节血肿的是26/27delTC,Tyr128Cys基因型者。出血程度与构成基因的合子型有关(P=0.040);杂合子与纯合子的出血程度差异有统计学意义(P=0.036)。出血程度与凝血酶原时间(PT)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ:C)无关(P=0.320、0.326)。结论遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症在我国目前有57种凝血因子Ⅶ基因突变,12种高危出血基因型,出血程度与合子型有关,杂合子患者出血程度轻,纯合子患者出血程度重,出血程度与PT、FⅦ:C无关。

遗传性凝血因子ⅩⅢ缺乏症两种新基因突变的确定

目的 探讨遗传性凝血因子 (F )缺乏症的基因缺陷。方法 采用PCR、核苷酸测序的方法对两个遗传性F缺乏症家系先证者及其亲属外周血白细胞基因组DNA的FA基因进行检测 ,并用RT PCR检测先证者外周血白细胞FA基因mRNA水平 ;ARMS PCR对 6 0名正常人外周血白细胞基因组DNA的FA基因进行检测。结果 ①发现两种新的基因突变 ,先证者 1在第 12 41位核苷酸由C突变为G ,位于外显子 10 ,导致Ser413Trp(TCGTGG) ,先证者 2及其妹妹在第 2 32位核苷酸由C突变为T ,位于外显子 3,导致Arg77Cys(CGCTGC) ,均为单碱基突变 ,无限制性内切酶酶切位点的改变 ;先证者 1的父母及先证者 2的父、母、舅则分别在DNA水平相同位点呈杂合状态。②采用ARMS PCR法分析正常人群未发现这两种突变的存在。③患者血浆存在少量FA ,而FA基因在mRNA水平几乎没有变化。结论 这两例F缺乏症患者均由于FA基因缺陷造成。患者的FA在细胞内不稳定、易降解可能是F缺乏的原因。家系 1的突变位点在F的核心区 ,对其结构功能的影响较为明显。而家系 2的突变位点位于F的表面 ,可能对蛋白的空间结构产生影响。

一种新的FⅩⅢ基因突变导致的遗传性FⅩⅢ缺陷症

目的对1例遗传性凝血因子ⅫⅠ(FⅫⅠ)缺陷症患者及其家系成员 FⅫⅠA基因[F(13)A]进行分析,探讨其分子致病机制。方法尿素溶解法定性检测 FⅫⅠ活性,抽提外周血基因组 DNA,PCR 扩增 FⅫⅠA基因的15个外显子及其侧翼序列,PCR 产物纯化后直接基因测序,并对家系成员F(13)基因相应的突变序列进行检测。结果先证者 FⅫⅠ定性试验阳性。基因测序发现先证者F(13)A存在纯合缺失,外显子10自127067位起缺失33个核苷酸(127067del33,GI:AF418272),导致阅读框内缺失11个氨基酸(406Met-416Ala),产生了由720个氨基酸残基组成的截短型 FⅫⅠA蛋白。其父母 FⅫⅠ定性试验为阴性,均显示为该序列的杂合缺失突变。结论先证者为遗传性 FⅫⅠ缺陷症患者,由 F(13)A 外显子10缺失突变所致。该突变为国际首次报道。

遗传性FⅦ缺陷症引起的婴幼儿颅内出血

目的 通过表型及基因分析,探讨1例非近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系的分子发病机制。方法 检测整个家系(共4人)的凝血指标来明确诊断包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FⅦ活性(FⅦ:C)等。PCR扩增先证者F7基因所有外显子包括侧翼序列、5’和3’非翻译区及其他家系成员相应的突变位点区域,测序后寻找突变位点,以反向测序验证突变位点;使用生物信息学软件(PolyPhen-2和MutationTaster)预测突变位点的致病性。结果 先证者PT(61.4 s)和FⅦ:C(8%)明显异常,家系中其余3位成员PT值均正常,FⅦ:C均略低于正常对照组;基因分析显示先证者F7基因1号外显子存在c.27_28delCT杂合无义突变,8号外显子存在Cys254Arg的错义突变,先证者父亲及哥哥的F7基因分析显示有Cys254Arg杂合型突变,先证者母亲的F7基因分析显示有c.27_28delCT杂合无义突变;生物信息学分析提示提示Cys254Arg突变有致病性。结论 该家系F7基因存在c.27_28delCT、Cys254Arg两种突变,复合杂合突变的存在是引起先证者FⅦ:C低水平的主要分子机制,也是引起先证者颅内出血的主要原因,先证者两种杂合突变基因分别遗传自杂合子父母。

九例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的分子发病机制与临床特性

目的探讨9个遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺陷症家系的基因突变类型与临床特征。方法检测凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间及FⅦ活性和抗原等指标以明确诊断；用PCR法扩增先证者F7基因的全部外显子及侧翼序列、5’和3’非翻译区。PCR产物纯化后直接测序，寻找基因突变，用反向测序证实所发生的突变。结果9个家系中的先证者凝血酶原时间均延长，FⅦ活性在2．0％～6．0％之间，7例先证者的FⅦ抗原显著减低。共发现8种F7基因突变，其中g．8355A〉T（Gln100Leu）、g．11243T〉C（Ser269Pro）和g.1520_11521insT3种突变为首次发现；6种突变发生在催化区；缺失突变和插入突变各1种，其余均为错义突变；所有的基因突变均来自先证者的父亲和（或）母亲，发现5个家系存在近亲婚配。g．27—28delCT、Cys329Gly、Arg304Trp和His348Gln突变在无亲缘关系的家系中重复出现。不同基因突变类型的临床表型有较大差异：2例His348Gln及1例Arg304Trp纯合突变可表现为轻型和无症状，2例g．27—28delCT纯合、杂合突变分别表现为中型、无症状，4例双杂合突变分别表现为1例（Ser269Pro和Cys329Gly）无症状、2例（Arg304Trp和Cys329Gly与Arg277Cys和g．1152011521insT）轻型、1例（Glnl00Leu和His348Gln）中型。结论中国汉族人群中存在导致F7基因缺陷的突变热点。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的临床表型与FⅦ活性、F7基因突变类型无明显的相关性。

双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子缺陷症

目的 探讨 1例遗传性凝血因子 (coagulation factor ,F )缺陷症及其家系基因突变的类型。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用 DNA直接测序法对先证者及其家庭成员 F 基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析 ,寻找基因突变 ;将含突变序列克隆入 p GEM T- easy质粒载体中 ,对所得两条染色体相应序列分别测序 ,以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶 Msp 对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析 ,证实测序所发现的突变。结果 先证者在第 8外显子上有两种基因突变 :11348位 C→ T突变和 11349位 G→ A突变。 p GEM T- easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区 Arg(CGG) 30 4 Trp(TGG)和 Arg(CGG) 30 4 Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为 11349位 G→ A和 11348位 C→ T杂合突变 ;其弟弟 F 基因为正常野生型 ;其哥哥和先证者的 3个子女均为杂合性突变。聚合酶链反应辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论 先证者 F 基因突变为不同染色体同一编码区 Arg30 4 Trp和 Arg30 4 Gln双重杂合性突变 ,此种突变类型的组合尚属首例。

纯合子His348Gln导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分析

目的对1个姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺乏症家系进行基因突变检测，探讨其分子发病机制。方法检测凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、血浆凝血因子活性等指标以明确诊断；用DNA直接测序法对先证者及家系成员FⅦ基因的全部外显子及侧翼、5’和3’非翻译区进行分析，寻找基因突变，用反向测序证实所发生的突变。结果先证者PT（30．9s）和FⅦ活性（3％）明显异常，女儿、父亲和母亲的PT（分别为21．2s、16．3s和16．1s）稍延长和FⅦ活性（分别为22％、25％和35％）减低，胞弟各指标均在正常范围内；先证者FⅦ基因第8外显子的11482位为纯合T→G导致氨基酸His348Gln；女儿、父亲和母亲为His348Gln杂合子，胞弟为正常野生型。结论该遗传性FⅦ缺乏症家系为纯合子错义突变His348Gln，推测此突变遗传自近亲结婚具有该杂合子的父母。

复合杂合性F11基因突变导致的遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系分析

目的对一个遗传性凝血因子Ⅺ(coagulation factor Ⅺ,FⅪ)缺陷症患者家系进行表型和基因检测,寻找致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法检测先证者及其家系成员的血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)含量、血浆凝血因子Ⅷ活性(coagulation factor Ⅷ activity,FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ活性(coagulation factor Ⅸ activity,FⅨ∶C )、FⅪ活性(FⅪ activity,FⅪ∶C)、凝血因子Ⅻ活性(coagulation factor Ⅻ activity,FⅫ∶C)和狼疮抗凝物(lupus antieoagulation,LA);ELISA法检测FⅪ抗原(FⅪ antigen,FⅪ∶Ag)等指标,明确临床表型诊断。采用DNA直接测序法分析先证者F11基因15个外显子、侧翼序列以及5′端、3′端非翻译区序列,发现突变位点后用反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。采用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2 、PROVEAN、SIFT和Mutation Taster 4个在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的影响;用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。结果先证者APTT为69.6 s,明显延长,其FⅪ∶C和FⅪ∶Ag均明显下降,分别为6%和10.7%;其母亲、姐姐、大妹、弟弟、女儿和儿子APTT均稍延长,FⅪ∶C和FⅪ∶Ag也均有不同程度下降(为正常对照的50%左右)。基因分析发现先证者F11基因第7外显子的c.738G>A(p.Trp228stop)杂合无义突变及第13外显子的c.1556G>C(p.Trp501Ser)杂合错义突变;其母亲、姐姐和女儿存在p.Trp228stop突变杂合子,大妹、弟弟和儿子存在p.Trp501Ser突变杂合子;其丈夫和小妹均为野生型。保守性分析结果表明,Trp501在同源物种间高度保守。4个生物信息学软件对该突变的预测结果一致:PolyPhen-2评分结果为1.000分,PROVEAN评分结果为-11.565分,均预示此突变是可能致病性的突变;SIFT评分结果为0.00分,预示此突变可影响蛋白质功能;Mutation Taster评分结果为0.9999分,预示此突变可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,在野生型FⅪ蛋白质中,非极性疏水的Trp501含有两个苯环,其主链和Gln512的主链形成1个氢键;当突变为极性亲水性的Ser501后,其两个苯环消失,原有的氢键没有改变,但其侧链与His396的苯环增加了1个氢键,导致蛋白质结构改变。结论该家系F11基因第7外显子c.738G>A杂合无义突变及第13外显子c.1556G>C杂合错义突变可能与该家系FⅪ水平减低有关。

非经典的剪接位点(IVS1a+5g>a)及His348Gln双杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的 探讨遗传性凝血因子Ⅶ (FⅦ )缺陷症分子发病机制。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对患者FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及 3′ ,5′非翻译区进行分析 ,寻找基因突变 ,对有突变的序列反向测序证实 ;发生在非经典的剪接位点突变用外周血单个核细胞异位转录的RT PCR方法确定其剪接方式。结果 患者在 8号外显子 10 96 1位发生T→G杂合突变 ,导致 348位His被Gln替代 ;在 1号内含子 5′端的非经典的剪接位点有Ggtgcg >Ggtgca(IVS1a+5g >a)杂合突变 ,RT PCR结果揭示剪接过程中去除了 2号外显子 ,却把 3号内含子包含进去 ,在 3号外显子起始处出现了移码突变 ,编码与原来氨基酸完全不同的 9个氨基酸后出现了终止信号 ,产生了一个只有 30个氨基酸组成的截短型蛋白。结论 患者FⅦ基因中发现了两种杂合突变 (10 96 1位T→G、IVS1a +5g >a) ,其中后一种非经典的剪接位点突变导致的异常剪接方式为国际首次报道。

8例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者基因诊断与临床特征分析

目的:探讨8例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者的基因突变类型与临床特征。方法:采用一期法检测患者的FⅦ活性(FⅦ:C),用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测其FⅦ抗原(FⅦ:Ag)水平;并抽提先证者及其家系成员的外周血基因组DNA,PCR扩增FⅦ基因所有外显子及其侧翼序列,采用DNA直接测序进行基因分析。结果:在8例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现9种类型的基因突变,包括3种剪切位点突变和6种错义突变,其中p.Glu76(16)Gln和p.Gly343(283)Asp这2种突变为国际首次报道。1例患者为p.Tyr128(68)Cys纯合突变,其FⅦ:C<1%,FⅦ:Ag为1%,临床表型为重度出血;另1例为p.Cys389(329)Gly纯合突变,其FⅦ:C为2.7%,FⅦ:Ag为50%,为交叉反应物质阳性(CRM+)的FⅦ缺陷症,其临床无出血表现。4例患者携带FⅦ基因双杂合突变,分别为IVS5-1G>A和p.Arg350(290)Cys、IVS5-1G>A和p.Cys389(329)Gly、IVS1a+5G>A和p.Glu76(16)Gln、IVS1a+5G>A和p.Gly343(283)Asp突变,其相应的FⅦ:C分别为4.9%、1.8%、2.2%和1.5%,患者临床出血症状较轻或无临床出血表现。2例患者携带单杂合突变,分别为p.Arg337(277)Cys和IVS5-2A>G,其FⅦ:C分别为4.5%和1.2%,前者无临床出血表现,后者有反复鼻出血。结论:在8例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现了9种类型的FⅦ基因突变,其中2种为新发现突变。IVS5-1G>A、IVS1a+5G>A、p.Cys389(329)Gly突变在8例患者中较常见,而FⅦ基因突变及FⅦ:C情况与患者的临床表型间无相关性。

Arg304Trp导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分析

目的对1例姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ,FⅦ)缺陷症家系进行表型与基因型分析。方法检测血浆中凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、FⅦ促凝活性(FⅦprocoagulant activity,FⅦ:C)及其它凝血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、启动子区进行分析,寻找基因突变,用反向测序证实所发现的突变。结果先证者的PT和FⅦ:C明显异常,分别为35.1s和3%;其父亲、母亲、大儿子和小儿子的PT稍延长,FⅦ:C明显降低。先证者FⅦ基因外显子8存在11348C→T纯合突变导致Arg304Trp;其父亲为该突变位点的杂合子,其母亲、大儿子和小儿子均为Arg304Trp杂合突变和Arg353Gln杂合多态性。结论先证者纯合突变Arg304Trp遗传自近亲结婚且具有相同杂合突变位点的父母。Arg353Gln多态性可能不是影响该家系成员血浆FⅦ:C水平的主要因素。

纯合子p.Gly1715Ser导致的遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系分析

目的 对一个由近亲婚配引起的遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺陷症家系进行实验室表型检测与基因突变分析,初步探讨其分子发病机制。方法 检测先证者及其家系成员(3代6名成员)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FⅤ活性(FⅤ:C)、FⅤ抗原(FⅤ:Ag)及其他相关凝血指标进行表型诊断。通过CAT法检测凝血酶生成量。采用DNA直接测序法分析先证者F5基因的所有外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及其家系成员相应突变位点区域,发现突变位点用反向测序证实。通过在线生物信息学软件(包括Mutation Taster、PROVEAN、SIFT及PolyPhen-2)预测和分析突变的致病性;用ClustalX-2.1-win分析突变氨基酸的保守性;利用Swiss-Pdb Viewer构建蛋白模型分析突变对蛋白质空间构象及功能的影响。结果 先证者PT和APTT均显著延长,分别为26.3 s/13.2 s和73.5 s/36.0 s;FⅤ:C和FⅤ:Ag明显降低,分别为3%和7%。先证者凝血酶生成试验峰高明显降低,延迟时间和达峰时间均显著延长,凝血酶生成潜力显著下降。基因分析显示先证者F5第16外显子存在c.5227G>A纯合错义突变(p.Gly1715Ser),其父亲、母亲、儿子和女儿均携带p.Gly1715Ser杂合子。保守性分析结果表明p.Gly1715Ser在同源物种间高度保守;PolyPhen-2、Mutation Taster、PROVEAN和SIFT四个软件对p.Gly1715Ser突变预测结果一致,均提示该突变为有害突变,可影响蛋白质功能。蛋白模型分析结果表明,p.Ser1715突变为p.Gly1715后,与周围氨基酸之间氢键发生改变并形成新的分子间作用力,使FⅤ蛋白空间结构发生改变。结论 该先证者F5基因第16外显子存在c.5227G>A纯合错义突变遗传自近亲婚配的父母,且c.5227G>A突变与该家系FⅤ水平降低有关。