HSV-1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免疫效果观察

目的构建HSV 1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体 ,并用此重组质粒直接免疫小鼠 ,探讨HSV 1gD基因作为基因疫苗的可能性。方法从HSV 1基因组中扩增 gD的全编码基因 ,克隆入载体 pUC19中 ,测序鉴定后转入真核表达载体 pcDNA3.1( +)。所得重组质粒pcDNA gD以电穿孔法转染CHO细胞 ,并以荧光染色法鉴定表达效果。用 pcDNA gD免疫小鼠 ,ELISA法检测基因免疫的应答效果。结果成功地构建了可在真核细胞中有效表达的HSV 1gD真核表达载体 ,用其直接免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答。结论 gD的真核表达载体有可能作为HSV 1的基因疫苗 ,为进一步研究基于 gD的表位生物学和表位疫苗奠定了基础。

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定

目的 为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法 用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果 构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论 本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的:克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法:从感染HSV-1F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30 cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30 cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1形成pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果:成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1F株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论:成功克隆出UL30 cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白D基因的分离克隆、定序及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ（含ｇＤ全基因）。重组质粒序列分析结果表明，ＭＤＶＧＡ株ｇＤ与ＭＤＶＲＢ１Ｂ株ｇＤ在ＤＮＡ和氨基酸序列组成上略显差异。将ｇＤ基因从重组的ｐＵＣ１８质粒中切出，插入表达性质粒ｐＥＺＺ１８载体中的葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）的信号肽基因的下游。对含ｇＤ重组ｐＥＺＺ１８质粒插入序列进行部分测序，结果表明，ｇＤ阅读框与ｐＥＺＺ１８中ＳＰＡ信号肽的阅读框是吻合的。ｇＤ重组ｐＥＺＺ１８质粒在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达ｇＤ，即ｇＤ与ＳＰＡ的信号肽（１４０００）相连。根据ＳＰＡ的信号肽可与ＩｇＧ结合的特性，用兔ＩｇＧ结合的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备的亲和凝胶柱来纯化表达的ｇＤ融合蛋白。纯化的表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定后，?

HSV-2病毒gD基因的扩增和测序

目的:确定单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)糖蛋白D的基因序列。方法:从3位生殖器疱疹患者中分离出3株HSV-2,提取标本中病毒DNA,通过PCR扩增gD基因并进行测序,用CLUSTALW排序软件和GENEDOC32软件进行分析。结果:样品1:有4个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.66%,并引起了4个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.24%。样品6:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%。样品8:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%。结论:三株野生株的gD基因序列与已公布的序列基本一致,说明HSV-2型的gD基因具有较强的保守性,可成为HSV-2型基因疫苗的侯选抗原。

Ⅰ型单纯疱疹病毒gD基因片段的高效表达及抗原性分析

目的:获得高表达的I型单纯疱疹病毒(HSV)被膜糖蛋白gD(简称gD1)基因的工程菌。方法:通过计算机分析,筛选出疱疹病毒gD1中优势抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插入表达载体pTrxA内,转化大肠杆菌Rosetta,以异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析表达产物。结果:PCR扩增出约930bp的gD1编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变。所构建pTrxAgD1重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致。含有pTrxAgD1重组质粒的大肠杆菌Rosetta诱导后得到了高效表达,SDSPAGE显示表达产物约48kDa。免疫印迹结果表明表达产物具有较好的抗原性。结论:成功构建了pTrxAgD1表达质粒,实现了成熟gD1蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达产物具有好的抗原性。

Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的克隆表达及初步鉴定

通过计算机分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列 ,筛选出HSV1 gG蛋白中优势抗原决定簇位点 ,用PCR技术扩增克隆含强抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至质粒表达载体pGEX 4T 2内 ,转化大肠杆菌TG1 ,构建成功了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌。用纯化的表达蛋白HSV1 gG GST作抗原ELISA分析证实有较好的抗原性和特异性 。

单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析

目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测.方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序.利用Lasergene,C lustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测.结果:完成单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆.通过B细胞抗原表位分析,发现HSV-1的gG-1和HSV-2的gG-2氨基端的同源性很低.gG-2蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位.结论:成功构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆,为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV -Ⅱ )Sav株感染的Hep - 2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV -II基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法获取胸苷激酶 (TK)基因 ,将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中 ,筛选阳性克隆测序 .结果表明 :本研究所获取的HSV -Ⅱ -TK基因全部编码区为 112 8bp ,编码 376个氨基酸 .结果表明 :本研究扩增出HSV -ⅡTK基因的全部编码区序列 ,并成功构建真核表达载体 pcDNA3/TK .

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法 从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸苷激酶 (TK )基因 ,将扩增的片段克隆入载体 pcDNA3 中 ,挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切 pcDNA3 /HSV ⅡTK ,得到目的基因TK ,将其克隆于已构建的真核表达载体 pcDNA3 /As上。结果 HSV Ⅱ TK基因全部编码区为 112 8bp ,基因序列与 genebank中报道相符。新质粒 pcDNA3 /HSV ⅡTK/As经限制性核酸内切酶 (BamHⅠ ,HindⅢ )酶切后得到 70 0bp(As)及 10 0 0bp(HSV ⅡTK)相应基因片段。 结论 本研究成功构建 pcDNA3 /HSV ⅡTK /As真核表达质粒。