Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的克隆表达及初步鉴定

通过计算机分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列 ,筛选出HSV1 gG蛋白中优势抗原决定簇位点 ,用PCR技术扩增克隆含强抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至质粒表达载体pGEX 4T 2内 ,转化大肠杆菌TG1 ,构建成功了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌。用纯化的表达蛋白HSV1 gG GST作抗原ELISA分析证实有较好的抗原性和特异性 。

Ⅰ型单纯疱疹病毒gG基因片段的高效表达、纯化

目的 获得具有优势抗原表位的Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的表达抗原并纯化鉴定。方法 用PCR技术扩增经分析筛选出的HSV1 gG蛋白中优势抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至PGEX 4T 2表达载体内 ,转化大肠杆菌TGl,对重组体进行诱导表达 ,表达产物主要以可溶性形式存在 ,使用硫酸铵沉淀后采用Sepharose阴离子交换层析进行纯化。纯化的蛋白抗原包被酶联板分别对抗HSV1 IgM阳性血清和正常人血清标本进行检测。 结果 在原核表达载体中成功地克隆了HSV1 gG ,电泳分析表明在相对分子质量 4 3 5kD处有HSV1 gG/GST融合蛋白的高效表达 ,并纯化获得了纯度达 90 %的表达蛋白。ELISA分析初步证实表达产物具有较好的抗原性和特异性。结论 成功地克隆、表达了高纯度的具有良好免疫原性的HSV1 gG蛋白 ,为研制高质量的HSV

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1糖蛋白BgB胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法从感染HSV-1的BHK细胞中提取总RNA用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Westernblot鉴定。结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量Mr约42000的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1400。结论获得重组HSV-1gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础。

2型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的表达及其抗原性分析

目的获得单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G(gG2)免疫优势片段gG321-580并初步研究其抗原性。方法 PCR扩增gG321-580基因,利用Bac-to-Bac表达系统表达gG321-580His融合蛋白,Western blot和间接ELISA鉴定蛋白活性。结果在Sf9细胞中成功表达HSV-2 gG321-580His蛋白,gG321-580His能与小鼠抗HSV-2 gG2单抗结合,在60 KDa附近出现特异性结合条带,ELISA分析初步证实gG321-580His能够与HSV-2阳性血清反应,而不与HSV-1阳性血清和正常人血清反应。结论 gG321-580His蛋白获得成功表达,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,为研究以gG321-580蛋白作为靶区域的HSV-2型特异性诊断试剂盒打下实验基础。

单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白免疫优势肽段在杆状病毒表达系统的表达及其反应原性

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对单纯疱疹病毒II型(HSV-2)糖蛋白G(gG-2)免疫优势片段gG321-580进行表达,纯化并评价其反应原性,以探索HSV-2免疫诊断试剂的研制。方法提取HSV-2DNA作为模板,PCR扩增gG321-580基因,克隆至pFastBac HTC载体中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gG321-580融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达产物,NTA-Ni 2+纯化后间接ELISA评价其反应原性。结果 HSV-2gG321-580在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组gG321-580蛋白对HSV-2阳性血清抗体有较好的抗原性和特异性。结论 gG321-580蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达,表达产物表现出良好的反应原性,为发展HSV-2免疫诊断试剂奠定了基础。

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D的晶体结构解析(英文)

Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（Glycoprotein D,gD）在介导该病毒入侵到宿主细胞中起着关键作用。为了更好地研究gD在病毒侵入过程中的作用机制,利用杆状病毒表达系统表达了gD胞外部分区域（1~285 aa）,通过Ni-NTA亲和层析以及分子排阻层析纯化后,得到的带His标签的分泌型可溶蛋白,用悬滴法对该蛋白进行了晶体筛选,获得了高质量的晶体。晶体生长条件为0.1 mol/L Hepes缓冲液（pH 7.2）,5%（V/V）2-甲基-2,4-戊二醇（MPD）,10%PEG10000,18℃。晶体能够衍射到1.8℃,属于P21空间群,晶胞参数为a=63.6,b=55.4,c=65.3,β=96.3°。该晶体的获得将为进一步研究gD的结构提供了基础,也为gD等同类囊膜蛋白的表达、纯化及结构研究提供了重要的参考。