何首乌饮介导DNMT1调控DNA甲基化促进大鼠Leydig细胞功能

为探讨何首乌饮介导基因表观遗传(DNA甲基化)的改变对大鼠睾丸间质细胞(Leydig)分泌睾酮的影响,选用12、18月龄Wistar雄性大鼠睾丸组织,甲基化芯片筛选出受何首乌饮调控并与精子发生功能密切的基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb,甲基化特异性PCR(MSP)与实时荧光定量PCR(RTqPCR)技术检测基因甲基化水平及mRNA表达水平;BrdU荧光染色观察细胞增殖情况;慢病毒转染敲低Leydig细胞DNMT1,分析wnt2b、C-myb甲基化程度和睾酮分泌水平是否受DNMT1影响.结果显示:何首乌饮可调控衰老大鼠睾丸组织中关键基因DNA甲基化和mRNA水平,促进细胞增殖和睾酮分泌;敲低Leydig细胞DNMT1后,细胞分泌睾酮水平降低,同时wnt2b和C-myb DNA甲基化水平也明显下降.这表明何首乌饮可能介导基因DNA甲基化程度促进大鼠Leydig细胞分泌睾酮,进而提高生精功能.

何首乌饮通过DNA甲基转移酶1延缓大鼠睾丸间质细胞衰老

目的探讨何首乌饮能否通过DNA甲基转移酶1(DNMT1)延缓大鼠睾丸间质细胞衰老。方法40只Wistar雄性大鼠随机分为4组,每组10只。免疫组织化学检测各组大鼠睾丸组织中DNMT1表达水平。ELISA实验检测各组大鼠血清中的睾酮含量。通过自由基氧化损伤建立大鼠睾丸间质细胞衰老模型。在睾丸间质细胞中使用慢病毒敲低DNMT1,通过β-半乳糖苷酶(β-GAL)染色、免疫荧光染色和ELISA实验检测细胞衰老状态和细胞上清液中睾酮和睾酮合成关键酶3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、细胞色素P450家族成员11A1(CYP11A1)的含量。结果与青年对照组相比,自然衰老组大鼠睾丸组织中P16蛋白表达和β-GAL阳性率明显升高,DNMT1表达和血清睾酮含量降低(P<0.05);何首乌饮干预能够降低衰老大鼠睾丸组织P16蛋白表达和β-GAL阳性率,提高DNMT1表达和血清中的睾酮含量(P<0.05)。衰老的睾丸间质细胞中呈现相同的趋势。在睾丸间质细胞中敲低DNMT1后,β-GAL阳性率和P16蛋白表达明显增加,睾丸间质细胞的睾酮分泌量和睾酮合成关键酶3β-HSD、CYP11A1含量明显减少,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。加入何首乌饮后,上述现象得到改善。结论何首乌饮可以通过DNMT1延缓大鼠睾丸间质细胞衰老。

何首乌饮对衰老大鼠睾丸组织细胞Rb/p53信号转导通路的影响

目的通过检测Rb、p16、p53、p19、p21在衰老大鼠睾丸组织中的表达,探讨何首乌饮抗大鼠睾丸组织衰老的机制。方法选用8周龄SD雄性大鼠84只,随机分为正常组、模型组、何首乌饮高、中、低剂量组、何首乌丸剂组、自然恢复组,每组12只,采用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老大鼠模型。采用免疫组织化学、Western blotting和RT-PCR法检测磷酸化Rb蛋白(pRb)、p16、p53、p19、p21在大鼠睾丸组织的表达差异。结果模型组大鼠睾丸组织Rb、p53、p16、p19、p21表达明显增加,pRb表达明显减少(P<0.05);何首乌饮、何首乌丸组能显著提高pRb的表达,降低Rb、p53、p16、p19、p21表达(P<0.05),何首乌饮高剂量组调节作用大于其他各组(P<0.05)。结论何首乌饮通过调节睾丸组织Rb/p53信号转导通路相关基因和蛋白表达起到延缓衰老的作用。

中药何首乌饮抗大鼠卵巢组织衰老的机理

目的探讨何首乌饮抗大鼠卵巢组织衰老的机理。方法36只SD大鼠随机分为3组:正常组、模型组、预防组。采用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型,预防组在造模的同时以中药方剂何首乌饮灌胃。应用逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠卵巢组织p53、p19ARF、Rb及p16基因的表达,用Western blotting方法检测各组大鼠卵巢组织Rb及p16蛋白的表达情况。结果何首乌饮明显抑制了衰老大鼠卵巢组织中p53、p19ARF、Rb以及p16基因表达的上调趋势(P<0.05),且明显降低了衰老大鼠卵巢组织中Rb及p16蛋白的表达(P<0.05)。结论何首乌饮抑制衰老途径中关键的调节因子p53、p19ARF、Rb及p16的表达,从而起到抗大鼠性腺衰老的作用。

何首乌饮对大鼠睾丸间质细胞类固醇激素合成急性调节蛋白和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶蛋白表达的影响

目的探究何首乌饮影响大鼠睾丸间质(Leydig)细胞类固醇激素合成急性调节蛋白(St AR)和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)蛋白表达的变化。方法选用10~20 d的幼年雄性Wistar大鼠,分离、培养Leydig细胞,然后收集。采用氧化损伤的方法建立Leydig细胞衰老模型。实验分组:间质细胞衰老模型组,何首乌饮处理组,首乌丸处理组,正常组和何首乌饮对照组。结果衰老模型组Leydig细胞St AR和P450scc的免疫组织化学染色强度明显低于正常组和何首乌饮对照组(P<0.01)。另一方面,何首乌饮和何首乌丸干预组St AR和P450scc的免疫组织化学染色强度明显高于衰老模型组(P<0.05),何首乌饮组好于何首乌丸组。结论何首乌饮可提高睾丸Leydig细胞St AR和P450scc蛋白的表达,提高睾酮的合成能力,从而延缓Leydig细胞衰老。

何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响

目的研究中药何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖及凋亡的影响。方法50只SD大鼠随机分为5组:阴性对照组,模型组,何首乌饮高、中、低剂量组,每组10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老大鼠模型。采用SP免疫组化法和原位末端标记法(TUNEL法)分别检测肾脏组织PCNA和凋亡的表达情况。结果①模型组大鼠肾脏PCNA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠(P<0.05)。何首乌饮各剂量组PCNA阳性细胞数高于模型组(P<0.05)。②模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组大鼠(P<0.05)。何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组(P<0.05)。结论何首乌饮可明显提高衰老大鼠肾脏的增殖能力并抑制其凋亡,具有一定的延缓衰老作用。

何首乌饮对亚急性衰老大鼠的抗氧化和调血脂作用

目的:探讨何首乌饮对亚急性衰老大鼠的抗氧化和调血脂作用。方法:D-半乳糖连续腹腔注射致亚急性衰老大鼠模型,造模同时灌胃何首乌饮10,20,40 g.kg-1.d-1,qd,连续给药60 d后测大鼠血清中丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性,并检测血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的含量。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠血清MDA,TG和TC含量明显升高,SOD,GSH-PX,TAOC和HDL-C明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,何首乌饮组血清MDA含量显著下降,血清SOD,GSH-PX活性,TAOC和HDL-C含量显著上升(P<0.05),呈现一定的剂量依赖性。结论:何首乌饮延缓D-半乳糖诱发的大鼠亚急性衰老的作用机制可能与其抗氧化和调血脂作用有关。

何首乌饮对衰老大鼠生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响

目的探讨何首乌饮对衰老大鼠睾丸生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响。方法选用12月龄Wistar雄鼠45只,随机分为3组:青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组,每组15只,何首乌饮组和自然衰老组于16个月开始分别灌胃何首乌饮和等量蒸馏水,连续60d。青年对照组于12月龄,其余两组于18月龄分别进行实验,通过Real-time PCR、免疫荧光染色和免疫印迹法,观察各组大鼠睾丸组织线粒体凋亡通路关键基因DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C、14-3-3σ的表达变化。结果自然衰老大鼠线粒体凋亡通路关键基因14-3-3σ表达明显低于青年对照组,DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C表达明显高于青年对照组;而何首乌饮用药后能明显逆转上述现象。结论何首乌饮提高衰老大鼠精子质量与线粒体凋亡通路有关。

何首乌饮对亚急性衰老大鼠卵巢细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的探讨何首乌饮对亚急性衰老大鼠卵巢细胞凋亡和相关基因Fas和FasL及其蛋白表达的影响。方法采用D-半乳糖连续腹腔注射致亚急性衰老大鼠模型,同时以何首乌饮灌胃作为延缓衰老组;造模后应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测各组大鼠卵巢细胞凋亡情况;测定各组Fas和FasL的信使核糖核酸(mRNA)水平;SP免疫组化法检测卵巢细胞Fas和FasL蛋白的表达情况。结果与正常对照组比较,模型组大鼠卵巢细胞中有凋亡细胞数增多现象、Fas和FasL的mRNA和蛋白表达均显著增强(P<0.01);延缓衰老组较模型组凋亡率明显下降(P<0.01),并抑制Fas和FasL的表达,呈现量效关系,以何首乌饮高剂量组效果作用最佳。结论何首乌饮方剂能延缓衰老大鼠卵巢细胞凋亡的发生,其作用机制可能是通过干预Fas/FasL的表达,阻止死亡信号的转导,抑制卵巢细胞凋亡。

中药何首乌饮对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2,bax表达的影响

目的通过测定不同剂量的中药何首乌饮含药血清作用后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达及caspase-3活性,探讨何首乌饮对卵巢自身功能的影响。方法制备排卵前卵巢模型,收集颗粒细胞分别与雌性SD幼鼠空白血清及含不同剂量何首乌饮的药物血清在体外共同培养,Western blotting检测GC内凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达情况;分光光度法检测颗粒细胞内caspase-3活性。结果何首乌饮含药血清可上调颗粒细胞bcl-2蛋白表达,下调bax蛋白表达,中、高剂量组何首乌饮含药血清与对照组比较,可明显上调bcl-2蛋白表达(P均<0.01),中、高剂量组何首乌饮含药血清与对照组比较,明显下调bax蛋白表达(P均<0.01)。何首乌饮含药血清可下调颗粒细胞caspase-3活性,中、高剂量何首乌饮含药血清组与对照组比较有显著性差异(P均<0.01)。结论何首乌饮增加GC内凋亡抑制蛋白bcl-2表达及减少凋亡促进蛋白bax表达的作用,可能是其抑制GC凋亡,防止卵泡闭锁的作用途径之一;同时何首乌饮可能是在凋亡的较早阶段,通过阻断caspase-3的级联裂解即可开始起效,而发挥凋亡抑制作用。

何首乌饮对衰老大鼠脑组织细胞Rb/p53信号转导通路影响

目的:检测Rb、p16、p53、p19、p21在衰老大鼠脑组织中的表达,探讨何首乌饮抗大鼠脑组织衰老的机制。方法:选用8周龄SD大鼠84只,体重180-220g,随机分为正常组、模型组、何首乌饮高、中、低剂量组、何首乌丸组、自然恢复组,每组12只,采用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老大鼠模型。免疫组织化学、W estern blotting和RT-PCR法检测pRb、p16、p53、p19、p21在大鼠脑组织的表达差异。结果:模型组大鼠脑组织Rb、p53、p16、p19、p2 l表达明显增加,pRb表达明显减少(P<0.05);何首乌饮、何首乌丸组能显著提高pRb的表达,降低Rb、p53、p16、p19、p2 l表达(P<0.05),何首乌饮高剂量组调节作用大于其他各组(P<0.05)。结论:何首乌饮调节脑组织Rb/p53信号转导通路相关基因和蛋白表达起到延缓衰老的作用。

何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺EGF、EGF mRNA表达的影响

目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺表皮生长因子(EGF)及EGFmRNA表达的影响。方法采用D-半乳糖衰老大鼠模型,何首乌饮干预分为治疗和预防两部分,用免疫组化及原位杂交法检测下颌下腺EGF、EGF mRNA阳性表达的改变。结果预防性实验部分EGF、EGF mRNA表达以正常组最高,模型组最低,各预防组中预防中剂量组最高,组间比较有高度统计学意义(P<0.01)。治疗性实验部分以正常组最高,自然恢复组最低,各治疗组中以治疗中剂量组最高,组间比较差异显著(P<0.01)。结论何首乌饮可提高下颌下腺EGF、EGF mRNA的表达而达到抗衰老的作用。

何首乌饮对雌性衰老大鼠下丘脑神经递质的影响．

目的探讨下丘脑衰老时神经递质的变化及何首乌饮延缓下丘脑衰老的作用机制。方法D-半乳糖连续腹腔注射致亚急性衰老动物模型,造模后灌胃何首乌饮连续60 d后,大鼠断头取下丘脑。采用ELISA法检测各组大鼠SP,β-EP和GnRH的含量;高效液相色谱法(HPLC)以SHIMADZU-10A高效液相色谱仪和L-ECD-6A电化学检测器检测下丘脑单胺类神经递质NA,DA,5-HT的含量。结果同正常对照组相比,模型组大鼠下丘脑GnRH、SP明显增高,β-EP与NA、DA、5-HT含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,何首乌饮组下丘脑GnRH、SP明显下降,β-EP与NA、DA、5-HT含量显著升高,呈现一定的剂量依赖性。结论衰老时大鼠下丘脑正常功能被破坏,何首乌饮通过对神经递质紊乱的调节而延缓了下丘脑的衰老。

何首乌饮对衰老大鼠生精细胞凋亡的影响

目的探讨何首乌饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。方法选用18月龄Wistar大鼠为自然衰老动物模型,以12月龄大鼠作为青年对照,采用原位末端标记法和流氏细胞术分别检测何首乌饮灌胃用药60 d和30 d的18月龄大鼠睾丸组织细胞凋亡率变化和DNA含量的变化。结果与青年对照组相比,自然衰老组睾丸细胞凋亡率明显增高,单倍体和4倍体细胞明显减少并以二倍体为主,G_1/G0期细胞明显增多(P<0.05),细胞增殖指数明显降低(P<0.05);而何首乌饮用药后与自然衰老组相比,细胞凋亡率明显降低(P<0.05);4倍体和单倍体比例明显增加(P<0.05),与青年对照组无显著性差异(P>0.05);细胞增殖指数明显升高(P<0.05),G_1/G_0期细胞明显减少(P<0.05)。结论何首乌饮可以抑制生精细胞凋亡,促进细胞增殖,达到延缓睾丸组织衰老的效果,但其具体作用机制有待研究。

复方何首乌饮对5/6肾切除大鼠肾保护作用的研究

目的探讨复方何首乌饮对5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭模型的肾脏保护作用及其可能的机制。方法大鼠行5/6肾切除术制造动物模型,造模成功后给药,于给药前及给药后4、8、12周采集样本,测定24 h尿蛋白、血尿素氮、血清肌酐的量及转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA在肾的表达。结果复方何首乌饮能显著性地降低24 h尿蛋白排泄量(P<0.05),降低血尿素氮、血清肌酐含量(P<0.05),同时抑制大鼠肾TGF-β1 mRNA的表达(P<0.05)。结论复方何首乌饮对5/6肾切除大鼠肾具有保护作用,其可能的机制为抑制TGF-β1 mRNA的表达。

何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺Bcl-2、Bax表达的影响

目的探讨何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺凋亡相关蛋白表达的影响。方法用免疫组织化学方法观察衰老大鼠下颌下腺Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果Bcl-2蛋白阳性表达在预防各组间以正常组最高,模型组最低(P<0.01)。治疗各组间以阴性对照组最高,自然恢复组最低(P<0.01),Bax蛋白的阳性表达在预防各组间以模型组最高,正常组最低(P<0.01)。治疗各组间以自然恢复组最高,阴性对照组最低(P<0.01)。结论衰老大鼠下颌下腺Bcl-2表达减少、Bax表达增加。何首乌饮可通过提高抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达、降低促凋亡蛋白Bax的表达而达到延缓细胞衰老、凋亡的目的。

何首乌饮对运动疲劳大鼠睾丸组织P450胆固醇侧链裂解酶和类固醇激素急性调节蛋白的影响

目的探讨何首乌饮对运动疲劳大鼠睾丸组织细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)和类固醇激素急性调节蛋白(StAR)的影响。方法 60只雄性SD大鼠,随机分为安静对照组(A组)、安静何首乌饮组(B组)、模型组(C组)、自然恢复组(D组)、何首乌饮治疗组(E组);何首乌饮预防组(F组),每组10只。C、D、E和F组大鼠复制运动疲劳动物模型,其中F组每天训练前给何首乌饮20g/(kg.d)(含生药4.8kg/L)灌胃60 d。模型成功后E组给何首乌饮20 g/(kg.d)(含生药4.8kg/L)灌胃治疗60 d。采用美国Beckmancoulter Unicel Dxl 800仪器测定睾酮水平;采用RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学法检测各组睾酮合成限速酶P450scc和StAR的表达变化。结果 P450scc免疫组织化学阳性颗粒主要表达于间质细胞及精母细胞,B组和F组表达最强,C组最弱,与其余各组相比差异有统计学意义。P450scc蛋白和mRNA表达变化为B、F组明显高于E、D和A组(P<0.05),C组明显低于A组(P<0.05),A组和D组以及B组和F组两两之间差异无显著性;StAR免疫组织化学阳性颗粒主要表达于睾丸间质细胞胞质,阳性强度表现为E组和F组最强,C组最弱。StAR蛋白和mRNA表达变化为E和F组明显高于A、D组(P<0.05),C组明显低于A组(P<0.05),A、D组之间无差异。结论何首乌饮可以提高睾酮合成限速酶P450scc和StAR的表达。

何首乌饮延缓大鼠睾丸间质细胞衰老与调控胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路的关系

目的探讨何首乌饮延缓大鼠睾丸间质(Leydig)细胞衰老与调控胰岛素/胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路的关系。方法采用氧化损伤的方法建立大鼠Leydig细胞衰老模型。用流式细胞术检测各组细胞周期的变化。应用Real-time PCR、免疫荧光和Western blotting技术检测Leydig细胞胰岛素/IGF-1信号传导通路关键基因的表达水平,并运用胰岛素受体/IGF受体特异性抑制剂BMS-754807处理细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果与正常组相比,衰老组β-半乳糖苷酶阳性细胞率可达60%(P<0.05),G1期所占比重明显增加,S期所占比重明显减少(P<0.05)。胰岛素/IGF-1信号传导通路关键基因表达变化:衰老组胰岛素受体(INSR),胰岛素受体底物(IRS1)、IRS2、IGF1表达水平明显低于正常组(P<0.05),胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)的mRNA表达明显高于正常组(P<0.05),何首乌饮可逆转上述现象。用BMS-754807处理衰老的Leydig细胞后,Bcl-2mRNA表达水平低于衰老组(P<0.05),用何首乌饮和BMS-754807同时处理衰老的Leydig细胞,细胞凋亡率高于何首乌饮组(P<0.05)。结论何首乌饮通过调控胰岛素/IGF-1信号传导通路延缓Leydig细胞衰老。

中药何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ及胰岛素样生长因子结合蛋白3表达的影响

目的探讨何首乌饮抗大鼠卵巢组织衰老的机理,为抗女性性腺的衰老研究提供理论指导和实验依据。方法将60只SD大鼠随机分为3组:正常组、模型组、预防组。采用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型,预防组在造模的同时以中药方剂何首乌饮灌胃。应用原位杂交方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)蛋白的表达,用RT-PCR方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)基因的表达情况。结果何首乌饮明显抑制了衰老大鼠卵巢组织中IGFBP3基因表达的上调趋势(P<0.05),且明显提高了衰老大鼠卵巢组织中IGF-Ⅰ蛋白的表达(P<0.05)。结论何首乌饮通过影响衰老大鼠卵巢中细胞因子IGF-Ⅰ、IGFBP3的表达,起到抗大鼠性腺衰老的作用。

何首乌饮对运动性疲劳大鼠睾丸组织17β-羟基类固醇脱氢酶表达的影响

目的探讨何首乌饮对运动性疲劳大鼠睾丸组织17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)的影响。方法 50只雄性SD大鼠随机分为5组,A组为安静对照组;B组为安静何首乌饮组;C组为模型组;D组为何首乌饮治疗组;E组为何首乌饮预防组,每组10只。C、D和E组大鼠复制运动性疲劳动物模型,其中E组每天训练前给予何首乌饮20g/(kg.d)(含生药9.6kg/L)灌胃作为预防。模型成功后D组大鼠给予何首乌饮20g/(kg.d)(含生药9.6kg/L)灌胃治疗60d。放射免疫法检测各组大鼠血清睾酮浓度,分别采用免疫组织化学法、Western blotting和RT-PCR检测各组大鼠睾酮合成催化酶的表达变化。结果 17β-HSD蛋白的阳性产物主要表达在睾丸间质细胞。17β-HSD mRNA及蛋白表达变化:与C组相比,D组和E组17β-HSD有显著性提高(P<0.05),而D组和E组无差异(P>0.05)。结论何首乌饮可以提高睾酮合成限速酶17β-HSD的表达。