BMSCs诱导分化为胆碱能神经元过程中干扰Hes1表达对Stmn1和Sept9基因的影响

目的:通过检测体外培养的骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)定向诱导分化为胆碱能神经元过程中干扰Hes1基因对Stmn1和Sept9基因的表达变化情况,探讨骨髓基质细胞定向分化为胆碱能神经元的机制。方法:采用全骨髓培养法体外分离培养获得BMSCs,将第三代培养的BMSCs进行诱导分化,实时定量PCR技术分析干扰Hes1基因后,在骨髓基质细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Stmn1和Sept9基因的表达变化情况。结果:BMSCs诱导分化为胆碱能神经元后,经免疫荧光检测有乙酰胆碱转移酶阳性细胞表达;Hes1基因表达在诱导组和干扰后诱导组中均较对照组高(P<0.05);Stmn1基因表达水平在干扰后诱导组、干扰组、诱导组均较对照组高(P<0.05);Sept9基因在干扰后诱导组和干扰组中表达水平均较对照组高(P<0.05),诱导组和对照组间无统计学意义。结论:在BMSCs向胆碱能神经元分化过程中,干扰Hes1基因可调控Sept9,Stmn1的表达,Hes1基因的表达变化导致与分化和增殖相关基因的表达改变。

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制。方法将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h。用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白。结果培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均<0.05。A、B、C组细胞凋亡率分为0.96%±0.17%、26.51%±3.74%、8.76%±1.40%,A、B组与C组比较,P均<0.05。与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均<0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均<0.05)。结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关。

β淀粉样肽对神经母细胞瘤细胞Notch信号通路的影响

目的:研究β淀粉样肽(Aβ)处理SH-SY5Y细胞以及α3神经型尼古丁受体(α3 nAChR)沉默细胞后细胞Notch信号通路的变化。方法:2μmol/L Aβ处理SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞,用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)和蛋白印迹(western blot)方法分别检测细胞中Notch信号通路中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平的变化,评价Aβ对细胞Notch信号通路的影响。结果:Aβ处理的SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平表达均增加,且在α3 nAChR沉默细胞中增加更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Aβ可增加细胞Notch信号通路基因表达,α3 nAChR沉默会增强Aβ对Notch信号通路基因表达的影响,这可能与阿尔茨海默氏病(AD)的发病有一定的关系。

Notch信号通路在小鼠肝癌细胞H22增殖凋亡中的作用及意义

目的观察Notch信号通路在小鼠肝癌细胞H22增殖和凋亡中的作用,并探讨其可能的机制。方法培养小鼠肝癌细胞株H22,将细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h。用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,应用免疫组化法检测各相关处理过的细胞株,RT-PCR、Western blotting法分别检测H22细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白。结果培养24、48、72、96 h后,A、B组与C组比较,细胞增殖差异明显(P均<0.05)。A、B、C组细胞凋亡率分别为25.52%±2.13%、0.91%±0.18%、8.91%±1.50%,A、B组与C组比较差异明显(P均<0.05)。与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均<0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均<0.05)。结论 Notch1信号通路在抑制小鼠肝癌细胞株H22增殖、促进其凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hesl、Bcl-2表达有关。

下调Notch1基因对前列腺癌PC-3细胞迁移和增殖的影响

目的 研究体外下调Notch1基因对前列腺癌细胞迁移和增殖能力的影响.方法 选取人前列腺癌PC-3细胞,分别转染Notch1的小干扰RNA（siRNA）序列（实验组）和阴性对照序列（阴性对照组）,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹技术分别检测转染后各组细胞中Notch1和其下游靶基因Hes1的表达.以Transwell小室法和MTS法分别检测细胞的迁移和增殖能力.结果 较之阴性对照组和空白对照组,实验组Notch1基因相对表达量显著降低（实验组3.960±0.510,阴性对照组36.097±1.941,空白对照组38.762±1.897）,差异具有统计学意义（P＜ 0.01）.在Notch1表达下调的同时,实验组中Hes1的表达也明显下降（实验组1.690±0.994,阴性对照组8.776±0.916,空白对照组9.803±1.001）（P＜0.01）.迁移实验中,实验组细胞数为（657.867±27.610）个,明显多于阴性对照组的（158.533±18.263）个和空白对照组的（146.933±15.733）个,差异有统计学意义（P＜ 0.01）.细胞增殖能力方面,开始检测时细胞增殖能力差异无统计学意义（P＞0.05）,实验组细胞在24、48、72 h的吸光度（A）值均高于两对照组细胞（均P＜0.01）.结论 下调Notch1基因可以促进前列腺癌PC-3细胞的迁移和增殖,这一效应可能是通过Notch1调节其靶基因Hes1实现的.

肿瘤干细胞调节基因Hes1在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨肿瘤干细胞调节基因发状分裂相关增强子1（Hesl）在结直肠癌中的表达及其临床病理特征与肿瘤预后之间的关系。方法前瞻性收集2004年8月至2006年9月，在南京中医药大学第三附属医院全国肛肠医疗中心行手术治疗的结直肠癌患者，146例结直肠癌患者建立队列，男84例（57．5％）、女62例（42．5％），平均年龄（61±11）岁。对患者肿瘤标本建立组织芯片并采用免疫组织化学方法检测Hesl基因表达，对患者随访并对相关资料进行统计学处理。结果在146例结直肠癌标本中，Hesl阴性或弱阳性表达占8％（12／146），阳性（＋）为77％（112／146），而阳性（＋＋）为15％（22／146）；单因素分析结果显示Hesl基因表达与分化程度有关（P=0．033）。134例成功随访，随访率91．8％，平均随访时间（42±13）个月，以Kaplan—Meier生存曲线估计该组患者总1年生存率93％（136／146）、总3年生存率74％（108／146）、总5年生存率67％（98／146）。肿瘤的预后与TNM分期和病理学类型均相关（均P：0．000），与Hesl基因表达不相关（P=0．267）。结论肿瘤干细胞调节基因Hesl表达与分化程度有关，多因素分析显示Hesl与生存不相关。

小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin^-造血细胞中的表达

目的构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率。方法通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达;将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达。结果测序证实重组逆转录病毒载体构建正确;转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95%,Hes1基因表达量约为对照组的5倍;病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7%,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。结论已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础。

肠上皮干细胞标志分子在小鼠放射性肠炎中的表达

目的探讨肠上皮干细胞标志分子Msil及Hesl在小鼠急性放射性肠炎（radiation enteritis，RE）模型中的表达情况。方法40只雌性BALB／c小鼠采用B射线进行以300cGy／min的速率一次性全腹部照射。选取30只小鼠于照射前（Od）及照射后第3、5、7、14天每天处死6只，分离小肠，截取小肠中段进行定量PCR、Western印迹及免疫组织化学法测定Msil及Hesl的表达，比较两者的表达差异。结果成功建立小鼠急性RE模型。定量PCR的结果显示，Msil和Hesl在第5天时表达的相对ACt值分别为15．17±0．47及15．83±0．24，Western印迹检测结果显示，Msil及Hesl于第5天表达的相对灰度分别为0．443±0．055和0．301±0．047，在RNA及蛋白质水平上两者均显著高于其他时间点（P值均〈0．05）。免疫组织化学检测结果显示，Msil和Hesl于第5、7天时在肠隐窝中大量表达。结论Msil及Hesl在RE的损伤修复前表达上调，提示肠干细胞的增殖与肠上皮修复有关。

人Hes1-shRNA，Hes5-shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人Hesl-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体，为Notch—Hes信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人Hes1，Hes5基因mRNA序列分别设计、合成多对互补的DNA单链寡核苷酸，退火后克隆至pENTR／U6入门载体。通过入门载体瞬时转染神经胶质瘤U251细胞筛选有效干扰序列。将含有效干扰序列的入门载体与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体进行LR重组构建Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体，经脂质体介导入293FT细胞，包装成慢病毒。用该慢病毒感染U251细胞，Western印迹法分别检测Hes1，Hes5蛋白的表达。结果分别构建了针对Hes1和Hes5基因的特异性shRNA慢病毒表达载体，其包装获得慢病毒可有效感染U251细胞并分别对HeM，Hes5蛋白的表达有显著抑制作用。结论成功构建了Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体。