橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST。采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124bp的5'端非编码区,337bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,命名为HbDHN1,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性。RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达。

一种体外检测橡胶粒子凝集技术的建立

乳管伤口堵塞是限制天然橡胶产量的直接因子,橡胶粒子的凝集在乳管伤口堵塞中起重要作用,分离鉴定橡胶粒子凝集相关蛋白对于揭示乳管伤口堵塞物形成和调节机制具有重要意义。最近,Wititsuwannakul等发明了一种染料结合法检测橡胶粒子体外凝集的技术,笔者对该技术涉及的各个环节进行优化,建立了一种简便、灵敏和重复性好的检测橡胶粒子体外凝集技术。几个关键参数为:(1)使用纯化的小橡胶粒子,适宜浓度为在600nm处的OD值为2.0～2.5;(2)用50mmol/LTris-HCl(pH7.4)配制0.5%碱性品红;(3)25℃条件下孵育30min;(4)5000r/min离心5min;(5)B乳清可作为阳性对照的蛋白质样品。该技术为进一步分离鉴定胶乳中橡胶粒子凝集相关蛋白质打下了良好基础。

机械伤害处理橡胶树萌条树皮的DNA甲基化分析

该研究采用甲基化敏感扩增多态性技术,分析了机械伤害处理橡胶树萌条树皮的DNA甲基化的变化。结果显示:(1)与对照相比,伤害后0.5和2h,DNA甲基化水平略有上升;伤害后48h的DNA甲基化水平出现了较大幅度的下降。(2)甲基化变化类型分析表明,在伤害2h主要发生了DNA的甲基化;伤害后48h,主要发生了DNA的去甲基化。(3)差异甲基化位点的回收、测序及注释表明,ATP合酶F1亚基1、磷酸核糖胺-甘氨酸类连接酶、冷激结构域蛋白3、光系统II 47kD蛋白、E3泛素蛋白连接酶RING1、NADH泛醌氧化还原酶和一些假定蛋白参与了伤害的响应。(4)经重亚硫酸盐测序验证,ATP合酶F1亚基1和NADH泛醌氧化还原酶的CCGG位点发生了去甲基化。研究推断DNA的甲基化可能参与了橡胶树萌条对机械伤害的响应。