人乳头瘤病毒L1基因分型国家参考品的升级换代研制

目的 对人乳头瘤病毒(HPV)L1基因分型国家参考品升级换代,以提高基于L1检测靶区的HPV核酸(分型)试剂的质量。方法 研制包含了34种不同型别HPV L1的质粒样品。经商业化核酸检测试剂复核验证,分装组成国家参考品。采用荧光PCR法进行量值标定,并溯源至WHO第一代HPV16 DNA国际参考品。结合不同实验室的协作标定研究和适用性验证结果,确定参考品的质量标准,并进一步考察参考品的稳定性。结果 国家参考品包括34种不同型别HPV样本和5种HPV阴性病原体,型别上囊括了HPV68a和HPV68b亚型。34种不同型别HPV DNA含量为6.26~7.08 Log10 IU/mL,并要求各试剂准确性应能检出其检测范围内的所有型别且分型正确,其检出限应不高于104 IU/反应。结论 成功建立了新一代HPV L1基因分型国家参考品,用于评价L1检测靶区的HPV核酸检测试剂的质量。

核酸分子杂交-流式细胞术检测HPV E6/E7 mRNA初步研究

目的探讨核酸分子杂交-流式细胞术检测HPV E6/E7 mRNA的可靠性和应用价值。方法收集2018年10月—2019年10月广东省妇幼保健院和中山大学附属第一医院妇科普通门诊常规宫颈癌筛查结果异常的361例已婚女性患者的子宫颈上皮脱落细胞样本,并进行新柏氏液基细胞学检测(TCT)、HPV DNA检测、HPV E6/E7 mRNA检测和组织病理学检查。结果HPV E6/E7 mRNA检测阳性率随组织病理学检查结果严重级别的升高而增加。与HPV DNA比较,HPV E6/E7 mRNA有较高的特异性(72.73%)和阳性预测值(47.06%)。当TCT结果为ASCUS时,依据HPV E6/E7 mRNA结果进行阴道镜检分流的正确率为66%。结论HPV E6/E7 mRNA检测与组织病理学检查有较高的一致性,且阴道镜镜检分流正确率和判断子宫颈组织高度病变的特异性、阳性预测值均较高。

一种人乳头瘤病毒核酸23个分型检测试剂盒的性能验证及评价

目的对某人乳头瘤病毒(23个分型)核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)进行性能验证。方法依据试剂盒说明书及CNAS-GL039依次对试剂盒的交叉反应、符合率、检测限、抗干扰能力进行验证与评价。结果人乳头瘤病毒(23个分型)核酸分型检测试剂盒与淋球菌、沙眼衣原体及解脲支原体不存在交叉反应;阴、阳性符合率为100%;该检测试剂盒检测限为104copy/mL,检出率100%;5%的血红蛋白和5%的咪康唑不会对人乳头瘤病毒分型检测造成干扰。结论该试剂盒交叉反应、符合率、检测限、抗干扰能力均符合要求,可满足本实验室的检测需求。

一体化核酸工作站在HPV分型检测中的应用评价

目的评价一体化核酸工作站在人乳头瘤病毒(HPV)分型检测中的临床应用价值。方法收集2021年4月至2021年8月于该院门诊进行宫颈癌筛查的241例患者的宫颈脱落细胞样本,每例样本均同步采用一体化工作站和分步式PCR流程检测HPV分型,一体化核酸工作站组为试验组,分步式PCR检测作为标准对照组,统计两种检测方法HPV分型的检测结果。结果一体化核酸工作站与标准PCR检验阳性符合率为99.26%,阴性符合率95.28%,总符合率97.51%;Kappa检验显示二者检测结果一致性良好(Kappa值0.949);器械重复性及稳定性较好;对10^(3)copies/mL以上水平28种HPV亚型能准确检出。结论一体化核酸工作站对HPV分型检测具有较高的准确率与灵敏度,诊断结果与分步式PCR检测检测结果一致性较好,证明一体化核酸工作站能够满足预期用途及HPV筛查的临床应用需求。

基于试纸条核酸提取和重组聚合酶扩增技术的HPV 16型DNA纸基电化学发光快速检测方法

目的建立一种人乳头瘤病毒(HPV)高危16亚型快速、灵敏、特异的检测方法。方法采用前期构建的试纸条法提取样本HPV DNA,并以其为模板,使用电化学发光试剂(酯化钌)标记上游引物,生物素标记下游引物,进行重组聚合酶恒温扩增,通过亲和素化的磁微球将生物素标记的扩增产物,在磁场的作用下富集,通过纸基电极-电化学发光检测技术,获得有酯化钌标记的待测物的浓度信息。结果酯化钌与上游引物以20∶1的摩尔比可以获得更高的标记效率和发光强度,该法最低检出限为50copies/mL,比实时荧光PCR的灵敏度高16倍;批内检测相对标准偏差低于5%,单个样本从核酸提取到获得扩增结果所需时间小于1h,具有较好的特异性、灵敏度和重复性。结论该法检测快速、灵敏、特异、操作简单,具有一定的临床应用价值。

人乳头状瘤病毒核酸定量检测与宫颈细胞学病理特征的相关研究

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)核酸定量检测与宫颈细胞学病理特征的相关性。方法选取2018年5月至2021年4月本院收治的82例宫颈病变患者作为研究对象。所有患者均接受HPV核酸定量检测并分析单位细胞内HPV病毒载量,分析不同宫颈病变患者病理特征与HPV阳性的关系,比较不同病理分型患者HPV病毒载量,分析HPV病毒载量与宫颈上皮内瘤变(CIN)分级的相关性。结果HPV核酸定量检测结果显示,82例宫颈病变患者中,HPV阳性人数61例,其中低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈癌患者中HPV阳性人数分别为19、18、24例。不同病理分型、宫旁侵润患者HPV阳性占比比较差异有统计学意义(P<0.05);不同年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移患者HPV阳性占比比较差异无统计学意义。随着患者宫颈病变程度提高HPV病毒载量呈升高趋势,差异有统计学意义(P<0.05);且HSIL、宫颈癌患者HPV病毒载量均高于LSIL患者,宫颈癌患者高于HSIL患者,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,HPV病毒载量与CIN分级呈正相关(r=0.767,P<0.05)。结论HPV核酸定量检测技术可对宫颈病变患者HPV感染情况及病毒载量进行准确分析,有助于临床对检查者宫颈病变程度及癌变风险做出准确诊断。

HPV L1壳蛋白在宫颈病变中的表达及与HR-HPV DNA的关系

目的研究人乳头瘤病毒(HPV)L1壳蛋白在宫颈病变中的表达及与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)DNA的关系,为宫颈病变的早期诊断提供预测指标,为HPV疫苗的研制提供理论依据。方法采用免疫细胞化学方法和第二代杂交捕获法(HC-Ⅱ),分别检测272例女性HPV L1壳蛋白的表达和高危型HPV(HR-HPV)病毒载量,组织活检复查宫颈病变情况。结果 HR-HPV DNA感染者中,随着宫颈病变级别(CINⅠ及以上)的升高,HPV L1壳蛋白阳性表达率增高(x^2=35.176,P<0.001),HPV L1壳蛋白诊断CINⅡ及以上的灵敏度为89.77%,特异度为45.12%;按年龄分层后,HPV L1壳蛋白表达与宫颈病变的OR均小于1;小于35岁研究对象中,病毒载量与HPV L1壳蛋白阳性表达率之间存在剂量反应关系(x^2=12.915,P<0.001)。结论 HPV L1壳蛋白的缺失与宫颈癌及癌前病变的发生、发展密切相关,年轻女性HPV L1壳蛋白的表达与HPVDNA载量存在剂量反应关系。

女性人乳头瘤病毒感染及基因型别分析

目的了解绍兴地区女性人乳头瘤病毒(HPV)各基因型感染检测的分布情况,以探讨HPV感染的临床意义。方法以核酸分子快速杂交仪为平台,利用导流杂交原理,样本经过PCR扩增后可同时检测21种HPV亚型的基因分型,包括15种高危亚型和6种低危亚型。结果 503例女性标本中,共检出阳性标本217例(43.14%),毒株亚型19种332株(含多重感染的重复计算);其中,低危亚型123株,高危亚型209株。低危亚型HPV感染主要以HPV6(18.98%)、HPV11(15.96%)为主,高危亚型主要以HPV16(12.95%)、HPV58(11.14%)、HPV52(10.84%)、HPV18(4.82%)等为主。检出单一感染HPV亚型145例(28.83%),多重感染72例(14.31%),包括二重感染48例(9.54%),三重感染16例(3.18%),四重及以上感染8例(1.59%),感染亚型最多的达9种。检测人群以21～40岁为主,最多的是21～25岁,感染高峰则出现在<25岁和>50岁以上两个年龄段,感染率远高于43.14%的平均水平。不同年龄群的感染均以单一感染为主,但感染有年轻化和低龄化的趋势。结论绍兴地区女性宫颈HPV感染率较高,开展各型HPV检测对于HPV感染的诊断、治疗及子宫颈癌的早期发现、预防和治疗具有重要意义。

分子生物学技术在HPV分型方面的应用进展

大量文献资料显示人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌发生密切相关,而且不同型别致病性有明显差异性,因而对HPV感染的及早发现和正确分型将对宫颈癌防治具有重要临床意义。本文重点综述了分子生物学技术在HPV检测方面的应用,并在综合了国内外有关资料的基础上,系统论述了PCR法、核酸杂交法以及基因芯片技术的优缺点,以期今后能为试验者在选择恰当试验方法时给与相应的参考。

宫颈液基细胞学和杂交捕获Ⅱ代检测筛查宫颈癌前病变和宫颈癌

目的:评价应用杂交捕获Ⅱ代(HC-Ⅱ)检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)和宫颈液基细胞学(LCT)筛查宫颈癌及其癌前病变的临床应用价值。方法:在中日友好医院妇产科进行宫颈癌筛查和诊治的948名妇女进行了HC-Ⅱ及LCT检查。对1项或2项结果异常者及宫颈外观呈重度炎症者进行组织病理学检查。结果:948名妇女中1项或2项结果异常者344例及2项结果均正常但宫颈外观呈重度炎症者23例,共计367例。对其进行组织病理学检查,发现宫颈炎症190例,宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级55例、CINⅡ级41例、CINⅢ级69例和宫颈浸润癌患者12例。组织病理学≥CINⅡ组与≤CINⅠ组比较,高危型HPV感染率有显著性差异(P<0.05)。LCT检测高级别CIN的敏感性为90.98%,HC-Ⅱ检测敏感性为95.08%。LCT和HC-Ⅱ两种检测没有关联性(χ2=0.18,P>0.05),同时检测可提高宫颈高度病变的检出率。结论:LCT和HC-Ⅱ检测在临床宫颈癌及其癌前病变的筛查中具有重要价值。

宫颈癌病理学类型与人乳头瘤病毒感染型别的关系

目的探讨宫颈癌病理学类型与人乳头瘤病毒感染型别（HPV-16和HPV-18）的关系。方法每例宫颈癌标本取样两份，一份进行组织病理学检查，包括HE、PAS和粘液卡红染色;另一份用于提取DNA，分别用HPV-16和HPV-18基因组探针进行核酸杂交。结果216例宫颈鳞癌分为角化型、大细胞型和小细胞型三种类型;41例宫颈腺癌分为粘液性腺癌、腺鳞癌和宫内膜样腺癌三种类型。核酸杂交结果表明，宫颈鳞癌中，HPV-16的感染率较高，HPV-18的感染率较低，二者比较差异有显著性（P＜0.01）;宫颈腺癌中，HPV-18的感染率较高，HPV-16的感染率较低，二者比较差异有显著性（P＜0.01）;不同类型的宫颈鳞癌之间比较，HPV-16的感染率差异无显著性（P＞0.05）;不同类型的宫颈腺癌之间比较，HPV-18的感染率差异无显著性（P＞0.05）。结论宫颈鳞癌与HPV-16感染密切相关，宫颈腺癌与HPV-18感染密切相关;而宫颈鳞癌中的不同类型与HPV-16之间以及宫颈腺癌中的不同类型与HPV-18之间均无明显的相关性。

宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析

目的分析山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型（HPV16）上游调控区（URR）和E7开放读码框（OFR）基因突变和基因序列多态性。方法收集山东省青岛地区妇女宫颈癌标本共111例,提取DNA作为模板,应用通用引物和型特异引物经聚合酶链反应（PCR）筛选HPV16阳性标本,PCR结合测序检测HPV16阳性标本URR和E7基因全序列,经DNAStar 100软件和在线BLAST分析其变异情况。结果宫颈癌组织中HPV和HPV16感染率分别为99.10%（110/111）和73.63%（81/110）;核苷酸水平上HPV16 URR形成24种变异模式,同源性在98.02%~99.26%之间,nt7518 G→A和nt7861 A缺失变异率均为100%（26/26）。HPV16E7形成12种变异模式,同源性在99.23%~100%之间;nt647 A→G突变率58.54%（24/41）,氨基酸由Asn→Ser（N29S）、nt666 G→A突变率24.39%（10/41）,为同义突变。结论山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中HPV16URR和E7基因均存在变异;HPV16 URR突变热点为nt7518和nt7861,HPV16 E7突变热点为nt647,且二者尚存在未见报道的变异位点。

磁珠法和煮沸法核酸提取在HPV-DNA分型中的比较

目的比较基于Pre-NAT全自动核酸提取系统的磁珠法与基于手工的煮沸法核酸提取在人乳头瘤病毒(HPV)-DNA分型中的应用。方法收集96份宫颈脱落细胞标本用于两种DNA提取方法检测结果的比对;利用同一混合阳性标本分装后加入系列水平的血红蛋白(Hb),评价抗Hb干扰能力;收集30份临床棉拭子标本,分析两种方法对皮肤破溃或男性生殖道分泌物DNA的提取效率。结果 96份临床标本,两种方法检测结果一致率为91.7%(88/96);磁珠法内参Globin及HPV各亚型的信号值均显著高于煮沸法(t=8.807、4.676,P<0.05)。Hb水平>17g/L时煮沸法HPV-DNA分型失败,而磁珠法信号值不受Hb干扰。30份棉拭子标本,磁珠法和煮沸法检测成功率均为80.0%,阳性率分别为54.2%、41.7%(P=0.564)。结论相比手工提取的煮沸法,基于Pre-NAT全自动病毒核酸提取系统的磁珠法具有操作简便、规范、通量高等优点。两种方法具有一定可比性,磁珠法核酸提取效率高于煮沸法,且不受Hb干扰,更适于临床应用。

人乳头瘤病毒16和18型核酸检测用质控品制备及其应用

目的制备可模拟真实临床标本的HPV-16和HPV-18核酸检测用质控品,并用于上海地区临床实验室的室间质量评价。方法分别选择整合有HPV-16和HPV-18 L1基因的宫颈癌细胞系(Siha和Hela)进行培养,收集细胞后用HPV国际标准品定值并分装,对其均匀性和稳定性进行评价,然后将样本盘发送至参评实验室,对回报结果进行分析评价。结果均匀性评价结果显示质控品间均匀性良好,稳定性评价结果表明质控品检测结果随时间延长无明显趋势变化。参评实验室对高浓度样本的检测符合率较高,低浓度样本的检测符合率较低。对于不分型项目,26%参评实验室由于上报假阴性结果导致出错。对于分型项目,不同检测方法的结果间没有显著差异,样本检测出错主要是因为错检或漏检某一亚型所致。结论制备的核酸检测用质控品的均匀性和稳定性良好,可有效用于临床实验室室间质量评价。质评结果显示上海地区参评实验室HPV核酸检测质量整体较好,个别实验室检测能力尚需提高。

上海地区女性生殖道人乳头瘤病毒感染的检测

应用地高辛甙元标记人乳头瘤病毒(HPV)-6,11,16和18探针,通过核酸杂交法检测上海地区女性患者HPV的感染。计活检组织标本128例,阴道脱落细胞130例,同时取样34例。斑点杂交结果表明活检组织中四种类型HPV的总阳性率:宫颈癌44％,宫颈间变66.7％,有间变史28.6％,外阴尖锐湿疣63％和慢性宫颈炎5.6％。阴道脱落细胞的各阳性率与之相近,同时取样的检测符合率为91.2％。Southern转移杂交结果提示:宫颈癌以HPV-16型为主。

用PCR-SSCP方法研究子宫颈癌组织中人乳头瘤病毒E_7基因的变异

运用核酸杂交和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）对临床确诊的６１份子宫颈癌Ⅱ～Ⅲ期标本进行了人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ７基因的检测。非同位素地高辛标记探针斑点杂交阳性检出率为４５．９％，ＰＣＲ检测阳性率为５４．１％，两种检测结果证实ＨＰＶ－１６型感染与子宫颈癌的发生密切相关。进一步用灵敏的单链构象多态性分析法（ＳＳＣＰ）对３３例阳性标本进行分析，发现有２７例单链ＤＮＡ迁移率与正常对照有不同，推测均发生了ＤＮＡ序列的改变，提示ＨＰＶ－１６Ｅ７基因的变异在子宫颈癌组织中是较常见的现象，其与子宫颈癌的发生有一定的关系。

PCR-反向点杂交技术在女性下生殖道人乳头瘤病毒感染分型检测的应用研究

目的探讨PCR-反向点杂交分型技术在临床人乳头瘤病毒(HPV)感染基因分型中的应用。方法采用PCR-反向点杂交分型技术,对1702例女性进行下生殖道23种HPV亚型感染筛查。结果 HPV总感染率为17.6%(300/1702),有21种型别被检出,感染率最高的为低危HPV43型(3.82%),其他型别分别为HPV16(3.70%)、52(2.70%)、6(2.47%)、58(1.88%)、18(1.76%)、56(1.53%)、68(1.29%)、11(0.88%)、33(0.82%)、66(0.71%)、59(0.59%)、53(0.53%)、42(0.53%)、31(0.35%)、73(0.24%)、51(0.18%)、35(0.18%)、83(0.12%)、45(0.06%)和39(0.06%),高危型感染13.9%(237/1702),低危型感染6.4%(109/1702),多型感染3.5%(59/1702);1702例HPV感染高峰年龄为大于或等于50岁(29.41%),各年龄段HPV感染检出率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR-反向杂交分型技术能够同时检测高危和低危HPV,可判断多型感染,在临床诊断和普查方面均有重要意义。

PCR 和探针杂交技术检测口腔粘膜疾病中人乳头瘤病毒的核酸

联合应用ＰＣＲ和核酸杂交的方法对１５份口腔粘膜疾病患者样品进行了分析。用ＰＣＲ技术测ＨＰＶ－１６为３份阳性，ＨＰＶ－１８为７份阳性；然后用探针杂交检测ＰＣＲ产物其ＨＰＶ－１６，３份阳性，ＨＰＶ－１８，１０份阳性。以上结果表明ＨＰＶ与口腔粘膜疾病有一定的关系；用ＰＣＲ扩增法和探针杂交法联合检测可提高检测率。

LMTIA技术检测HPV核酸的可行性研究

为研究梯型熔解温度等温扩增(LMTIA)技术检测人乳头瘤病毒(HPV)核酸的可行性,分析高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的基因组,选择熔解温度曲线呈梯型的特异性序列,合成特异性序列并克隆到pUC57载体上作为DNA模板,通过设计LMTIA引物、优化反应温度来测定灵敏度.结果表明,所建立的9种HPV高危型病毒LMTIA检测方法在最适温度下稳定性强,对pUC57质粒模板DNA的检测灵敏度为0.1~1 fg/reaction.LMTIA方法稳定性强、灵敏度高,在检测HPV核酸方面具有广阔的应用前景.

PCR联合HPV检测在宫颈癌筛查中的应用

目的探讨荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒(HPV)分型核酸测定在宫颈癌癌前病变筛查中的应用及其临床效果。方法选取2016年4月~2018年4月我院收治的宫颈癌患者86例,分为对照组和研究组,对照组患者接受荧光PCR法进行检测筛查,研究组患者在应用荧光PCR法的基础上联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定进行筛查,同病理诊断结果进行对比。结果研究组检测出的高危型人乳头瘤病毒感染率高达75.6%,研究组检测出的高危型人乳头瘤病毒感染率高于对照组(P<0.05),40~49岁年龄段的人群感染率最高为82.1%,不同年龄阶段高危型人乳头瘤病毒感染的情况不同(P<0.05)。结论荧光PCR法联合高危型人乳头瘤病毒分型核酸测定在宫颈癌癌前病变筛查当中有着非常重要的作用以及对于医学检测具有指导意义,检出率更高,效果理想,临床上应当进一步推广应用。