免疫复合物AtgG刺激小鼠肾小球系膜细胞增殖过程中Hint2基因的表达和作用研究

目的观察免疫复合物AIgG刺激小鼠肾小球系膜细胞（GMCs）后不同增殖状态下Hint2-mRNA的表达量变化情况及Hint2蛋白过表达对免疫复合物AIgG刺激的小鼠GMCs不同增殖状态下的影响。方法（1）采用CCK-8法检测免疫复合物AIgG刺激体外培养小鼠GMCs增殖的量-效和时-效关系。（2）采用SYBRGreenReal—timePCR技术检测不同浓度的AIgG（0、1000、2000tJg／m1）刺激小鼠GMCs增殖后的Hint2-mRNA表达量的变化情况。（3）依次构建Hint2-Pmdl9克隆载体及Hint2-MigRl表达载体，采用磷酸钙共沉淀法将MigRl和Hint2-MigRl质粒分别成功转染小鼠GMCs。（4）将MigRl和Hint2-MigRl质粒分别转染小鼠GMCs后，并用流式细胞术将两者转染效率调整至一致，分别予不同浓度的AIgG（0、1000、2000μg／ml）刺激小鼠GMCs36h后，再用流式细胞术检测两者转染细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达的阳性率。结果（1）AIgG对体外培养小鼠GMCs具有明显的促增殖作用，以2000μg／ml组作用最强。（2）Hint2-mRNA的表达量与小鼠GMCs的增殖状态呈负相关。（3）MigRl和Hint2-MigRl质粒通过磷酸钙共沉淀法均能成功转染小鼠GMCs，于荧光倒置显微镜下可见GFP阳性的细胞，FCM检测两者转染效率分别为38．22％和20．44％。（4）FCM检测不同浓度的AIgG刺激转染小鼠GMCs中GFP的阳性率：Hint2蛋白过表达组和对照组水平的差异均无统计学意义。结论Hint2-mRNA的表达量与小鼠GMCs的增殖状态呈负相关；单独Hint2蛋白过表达对小鼠GMCs的增殖状态未见明显影响。

HINT2抑制脂多糖诱导的HaCat细胞炎症反应

目的研究上调人三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(histidine nucleotide binding 2,HINT2)表达对人上皮细胞HaCat细胞中脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的炎症反应的影响。方法用慢病毒转染的方法构建HINT2过表达的HaCat细胞株HaCat^(HINT2);Western blot检测细胞HINT2的蛋白表达;LPS作用细胞6 h后,以Real-time PCR和ELISA分别检测培养细胞TNF-α、IL-6、IL-10的mRNA表达水平及其在细胞培养上清中的分泌量,Western blot检测PI3K/AKT通路及NF-κB通路的蛋白变化。结果Western blot证明高表达HINT2的HaCat细胞(HaCat^(HINT2))构建成功;LPS诱导后,HINT2高表达组的TNF-α、IL-6 mRNA表达低于对照组(HaCat^(control)),IL-10的mRNA表达高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);HINT2高表达组培养上清液中的TNF-α、IL-6分泌量低于对照组,IL-10分泌量高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);高表达HINT2可降低由LPS刺激引起的NF-κB信号通路p65蛋白磷酸化。结论高表达HINT2可以显著抑制HaCat细胞中LPS诱导的炎症反应以及NF-κB信号通路的激活。

Hint2促进乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液的敏感性

目的探讨高表达三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2)增强人乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液敏感性的影响。方法构建高表达Hint2的载体pCMV-HA-Hint2并转染MCF7细胞,通过免疫荧光和Western blot方法检测Hint2的表达,采用噻唑蓝(MTT)法检测高表达Hint2后MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性,采用流式细胞AnnexinV方法检测细胞凋亡。结果 pCMV-HA-Hint2转染36 h后,细胞的Hint2基因表达明显增加,5μmol.L-1的紫杉醇注射液处理24 h后,Hint2高表达组细胞活性为33.78%,而对照组细胞活性为44.12%。结论 Hint2高表达能显著增加MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性。

Hint2基因过表达质粒的构建及其对肝癌细胞BEL-7402迁移的影响

目的探讨Hint2基因过表达质粒的构建及其对肝癌细胞BEL-7402迁移的影响。方法根据Hint2基因设计引物,扩增Hint2基因全长并以pcDNA3.1(+)为载体构建Hint2过表达质粒。转染BEL-7402细胞提取m RNA和总蛋白,分别使用Real-time PCR和Western blot检测转染细胞Hint2 mRNA和蛋白质表达的变化,应用免疫荧光染色法对细胞中Hint2蛋白与细胞线粒体进行共定位。使用划痕愈合实验检测Hint2过表达后对肝癌细胞BEL-7402迁移能力的影响。结果转染Hint2过表达质粒细胞的Hint2 mRNA和蛋白表达显著上调,免疫荧光染色表明过表达的Hint2蛋白定位于线粒体。划痕愈合实验表明Hint2过表达质粒使肝癌细胞BEL-7402迁移速率显著降低。结论 Hint2过表达质粒能够上调BEL-7402细胞中Hint2m RNA和蛋白质的表达水平,表达的蛋白定位于细胞线粒体并抑制肝癌细胞的迁移。

HINT2在甲状腺乳头状癌中的表达和功能研究

HINT2与多种肿瘤发生发展密切相关,在甲状腺癌中的功能还不清楚。该文使用组织芯片检测甲状腺乳头状癌组织中HINT2的表达,发现12例癌组织中HINT2蛋白表达水平显著高于正常组织(86%,P<0.05)。该文构建高表达和低表达HINT2的甲状腺乳头状癌细胞系K1稳定克隆后,使用CCK8和克隆形成实验检测HINT2对细胞增殖能力的影响,采用Transwell和划痕法检测细胞迁移能力,使用Matrigel Transwell法检测细胞侵袭能力。结果发现,高表达HINT2促进了K1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而干扰HINT2则抑制了细胞的这些恶性表型。最后,该文用Western blot方法检测AKT和ERK的活化情况,发现高表达HINT2促进AKT和ERK的磷酸化,而干扰HINT2则抑制AKT和ERK的磷酸化。这些结果说明,HINT2可能是甲状腺乳头状癌的原癌基因,通过调控PI3K/AKT和MAPK/ERK通路影响甲状腺肉头状癌的恶性表型。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性。方法提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒p GL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染He La细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性。结果质粒p GL3-h1(-6--463,457bp),p GL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌He La细胞。转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果显示p GL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而p GL3-h1为67936,p GL3-h2为64234.19。空质粒与p GL3-h1,p GL3-h2之间差异具有统计学意义,而p GL3-h1,p GL3-h2之间差异不具有统计学意义。结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性。

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1和2与疾病相关的研究进展

组氨酸三聚体核苷结合蛋白(HINT)属于HIT蛋白超家族,HINT1和HINT2基因分别位于人类染色体5q31.2和9p11区域,编码产物分别是含126和163个氨基酸的蛋白,相对分子质量分别约14 kDa和17 kDa,二者之间有61%的序列同源性。HINT1在细胞中定位于细胞质和细胞核,HINT2定位于线粒体,二者在组织中分布广泛。HINT1和HINT2两个亚型均为肿瘤抑制因子,参与细胞增殖和凋亡,HINT1可通过调节Wnt/β-catenin信号通路以及p27^(KIP1)、AP1、TFIIH、MITF等转录因子的活性抑制肿瘤,HINT2可通过线粒体自噬和线粒体凋亡途径抑制肿瘤。该文就HINT1和HINT2的发现、分布、结构、酶活性、肿瘤作用机制及其与其他疾病的关系进行了系统综述并进行展望。为进一步揭示HINT1和HINT2在不同类型肿瘤中的分子抑制机制以及靶向治疗和药物研发奠定了理论基础。