小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白。方法:根据GenBank中的TaCKX1序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKX1编码基因的批pMD-QRCKX1重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKX1基因的DNA片段。将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKX1已构建成功。提取pET-TaCKX1质粒转化到BL21(DE3)plysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。结果:在大肠杆菌中获得TaCKX1基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.9kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大。选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白。经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白。结论:小麦TaCKX1基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKX1蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础。