亚砷酸钠对人永生化皮肤角质形成细胞组蛋白H3K9me2及组蛋白去甲基化酶JHDM2A和JHDM2B表达的影响

目的探讨亚砷酸钠对人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)组蛋白H3K9me2及组蛋白去甲基化酶JHDM2A、JHDM2B表达的影响。方法将对数生长期HaCaT细胞暴露于含终浓度分别为0.00(对照)、2.50、5.00、10.00μmol/L亚砷酸钠的DMEM高糖培养基染毒24 h。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中的JHDM2A、JHDM2B mRNA表达水平,采用免疫印迹法检测H3K9me2修饰水平和JHDM2A、JHDM2B蛋白表达水平。结果与对照组比较,5.00、10.00μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞H3K9me2蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05),且亚砷酸钠剂量与H3K9me2蛋白的表达水平呈负相关(r=-0.898)。各亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞中JHDM2A和JHDM2B mRNA和蛋白的表达水平与对照组比较无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论亚砷酸钠可以诱导组蛋白H3K9me2表达降低,但不能改变组蛋白去甲基化酶JHDM2A和JHDM2A的表达水平,JHDM2A、JHDM2B可能不参与砷致HaCaT细胞组蛋白H3K9me2的去甲基化作用。

CRISPR/Cas9技术在组蛋白去甲基化酶Kdm^(2)b基因大片段敲除小鼠模型构建中的应用

目的观察CRISPR/Cas9技术在组蛋白去甲基化酶Kdm^(2)b基因大片段敲除小鼠模型构建中的应用效果。方法首先,在Kdm^(2)b基因第7个外显子的5’端和第9个外显子的3’端各设计两个向导RNA(sgRNA),分别插入PX459载体构建重组质粒;将四种sgRNA的重组质粒两两组合(sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2),然后转染入小鼠NIH3T3细胞,筛选出sgRNA3-2和sgRAN5-2为Kdm^(2)b基因敲除的最佳组合。对3~6周龄C57BL/6母鼠进行诱导排卵,使之与公鼠交配,授精成功后处死母鼠,取出受精卵,放入培养液中培养。最后,利用细胞质显微注射技术在小鼠原核期胚胎中注射sgRNA3-2、sgRAN5-2和Cas9的mRNA,将存活的胚胎移植到假孕母鼠输卵管壶腹部。待小鼠出生1周左右,剪取尾尖,用酚/氯仿法抽提尾尖中的基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳及基因测序;纯合子小鼠在出生4周后,观察其表型。结果最终获得13只小鼠。经过基因鉴定,Kdm^(2)b基因大片段缺失的纯合子小鼠1只,杂合子小鼠3只,另外9只Kdm^(2)b基因未见改变;纯合子小鼠鼠尾组织中Kdm^(2)b基因中的外显子7至外显子9基因序列缺失。纯合子小鼠在初生4周后,出现卷尾。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建了去甲基化酶Kdm^(2)b基因大片段敲除的小鼠模型。