HIWI基因在膀胱移行细胞癌细胞株中的表达

目的研究HIWI基因在膀胱移行细胞癌细胞株T24、EJ、MGH-U1、BIU-87中的表达。方法应用RT-PCR和Western blot方法对HIWI基因在膀胱癌细胞株中的表达情况进行检测。结果HIWI mRNA在膀胱癌细胞株T24、BIU-87细胞株中有表达;HIWI蛋白在膀胱癌细胞株T24、BIU-87细胞株中有表达,而在EJ、MGH-U1膀胱癌细胞株中没有表达。结论HIWI可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点,可为基因治疗靶点的体外实验研究提供实验基础。

Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达

目的检测Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达情况。方法应用免疫组织化学方法,对Hiwi基因在膀胱癌组织切片中的表达情况进行检测。结果Hiwi蛋白表达的阳性细胞百分率在不同临床分期的膀胱移行细胞癌即浅表性膀胱癌(Tis、Ta、T1)和浸润性膀胱癌(T2、T3、T4)之间存在显著性差异,(P<0.01)。Hiwi蛋白的阳性表达率随病理级别增高而递增,不同病理分级(G1、G2和G3)之间存在显著性差异,(P<0.01)。结论Hiwi基因可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点,并作为基因治疗靶点的体外实验研究提供了实验基础。

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。

Hiwi基因在耐药MCF-7/ADM乳腺癌细胞株中的表达

目的探讨Hiwi基因在耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADM细胞和非耐药MCF-7细胞的表达.方法应用实时定量PCR与Western blot技术进行Hiwi基因在耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADM细胞和非耐药MCF-7细胞株表达水平检测.结果 Hiwi基因在耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADM细胞中的表达明显高于正常乳腺细胞(P<0.01)及非耐药MCF-7细胞(P<0.05).结论 Hiwi基因在耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADM细胞株的高表达为耐药乳腺癌细胞的靶向治疗指出新的研究方向,对乳腺癌治疗预后评估具有临床指导性.

HIWI基因沉默对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的:利用基因转染和RNA干扰(RNAi)技术,研究HIWI基因沉默对T24细胞生物学行为的影响,探讨HIWI基因作为抑制膀胱癌细胞增殖分子靶点的可能性。方法:实验分为转染pGenesil-2-HIWI1组、转染pGenesil-2-HIWI2263组、转染阴性对照质粒pGenesil-2-control组,只加转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)的对照组和只加入PBS的阴性对照组,每组设4个平行样。利用PEI介导,将靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体瞬时转染T24细胞,通过MTT法及流式细胞仪检测各组细胞增殖和细胞周期的改变。结果:转染后24 h,转染组的细胞增殖抑制率分别为32.60%和26.09%,较对照组细胞增殖抑制率(3.54%)明显降低(P<0.01)。转染后48 h,转染组S期细胞百分数[(29.39±3.27)%和(30.87±10.88)%]较对照组[(39.36±2.09)%]明显降低,G2/M期细胞百分数[(9.39±0.80)%和(11.46±1.53)%]较对照组[(5.57±0.40)%]明显增加(P<0.05)。结论:HIWI基因沉默对T24细胞具有增殖抑制作用,HIWI基因可以作为抑制膀胱癌细胞增殖的分子靶点;HIWI基因沉默对膀胱癌具有潜在的治疗价值。

靶向Hiwi基因的siRNA干扰对诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的:探讨干扰Hiwi基因对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响。方法:培养并转染三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231,按照实验设计分为6组,转染后应用q RT-PCR、Western blot分析Hiwi基因的m RNA及其靶蛋白的表达情况,根据结果评估干扰效果筛选有效的si RNA干扰片段作为干扰组(Hiwi10330组),再按照试验设计分为3组分别是干扰组,阴性对照组(NC组)、空白对照组(Blank组),在细胞转染后进行细胞流式检测各实验组细胞凋亡率。结果:靶向Hiwi基因的si RNA干扰后,干扰组中m RNA的表达量明显降低(P<0.05),Hiwi基因靶蛋白的表达也出现了明显的抑制(P<0.05)。靶向Hiwi基因的si RNA干扰后,干扰组MDA-MB-231细胞的凋亡率与NC和Blank组相比明显升高(P<0.05)。结论:si RNA靶向沉默Hiwi基因后,乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡率明显升高,提示Hiwi基因可能成为三阴乳腺癌的一潜在治疗靶点。

靶向Hiwi基因的shRNA表达载体的干扰效果评价

目的评价靶向Hiwi基因的shRNA表达载体的干扰效果。方法通过构建靶向Hiwi基因的短发夹RNA(shout-hairpin RNA,shRNA)真核表达载体pGenesil-2-Hiwi1和pGenesil-2-Hiwi2263,并以pGenesil-2-control为阴性对照,转染膀胱癌T24细胞,从mRNA和蛋白水平观察3种干扰载体的干扰效率。结果pGenesil-2-Hiwi1和pGenesil-2-Hiwi2263组膀胱癌T24细胞Hiwi mRNA与GAPDH灰度比值较Normal control组Hiwi mRNA与GAPDH灰度比值显著降低(P<0.01),pGenesil-2-control、pGenesil-2-Hiwi1和pGenesil-2-Hiwi2263的干扰效率分别为5.7%、100%和100%。pGenesil-2-Hi-wi1和pGenesil-2-Hiwi2263组膀胱癌T24细胞Hwi蛋白与GAPDH灰度比值较Normal control组Hiwi蛋白与GAPDH灰度比值明显著降低(P<0.01),pGenesil-2-control、pGenesil-2-Hiwi1和pGenesil-2-Hiwi2263的干扰效率分别为3.2%、74.2%和64.5%。结论pGenesil-2-Hiwi1和pGenesil-2-Hiwi2263表达载体沉默膀胱癌T24细胞中Hiwi基因表达,干扰效率较高,为今后通过RNAi技术抑制Hiwi基因表达,从基因与蛋白质水平探索Hiwi基因在干细胞及肿瘤中的作用打下基础。

Hiwi基因靶向沉默对乳腺癌MCF-7/ADM细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADM细胞应用Hiwi基因靶向沉默技术后对阿霉素敏感性的变化,阐明Hiwi基因在乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药机制中的作用。方法:MCF-7/ADM细胞分为对照组、Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组,分别转染Hiwi control、Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2 3种不同载体,应用实时定量PCR和Western blotting法检测Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平,判断转染效率。转染后各组乳腺癌MCF-7/ADM细胞加入不同浓度阿霉素(0、0.1、0.5和1.0mg·L^(-1)),0mg·L^(-1)阿霉素组为对照组,采用MTT法检测各组MCF-7/ADM细胞的存活率,即耐药敏感性。结果:与对照组比较,转染后Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2组细胞中Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)。与对照组比较,经不同浓度阿霉素作用后,Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组细胞存活率明显降低(P<0.01),阿霉素浓度为1.0mg·L^(-1)时,2组细胞存活率分别为(48.15±6.28)%和(41.73±6.17)%,对阿霉素的敏感性明显增强。结论:Hiwi基因在MCF-7/ADM细胞中具有高效的靶向沉默,Hiwi基因沉默后的MCF-7/ADM细胞对阿霉素恢复敏感性。

Hiwi基因在肿瘤形成中的意义

肿瘤干细胞学说的提出为肿瘤发生的分子机制、诊断及治疗提供了新的思路。近年来的研究发现,Hiwi基因作为Piwi基因家族的一员,参与干细胞的自我更新、增殖及分化工程的调控,对肿瘤治疗及预后评估等具有重要的意义。本文就Hiwi基因在肿瘤形成中的意义作一综述。

Hiwi基因表达对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的探讨Hiwi基因表达对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法使用western blot法分析62例乳腺癌患者的病理组织标本和24例确诊乳腺组织功能正常无癌变现象的志愿者的组织标本的Hiwi表达水平。结果 Hiwi在乳腺癌组织中的表达水平(1.708±0.065)显著高于正常乳腺组织中的表达水平(0.706±0.044), P <0.05。正常表达组的穿膜乳腺癌细胞数为(73.55±6.43)个,显著高于下调表达组的穿膜乳腺癌细胞数(46.71±6.15)个, P <0.05。结论 Hiwi基因表达水平与乳腺癌癌细胞侵袭和转移能力正相关。Hiwi基因有可能成为良好的乳腺癌检测指标和治疗靶点。

Hiwi基因在肝癌组织中的表达

目的研究Hiwi基因mRNA及Hi wi蛋白在肝癌组织中的表达。方法92例肝癌及癌旁组织标本,应用RT-PCR、Western blot及免疫组化方法分别检测肝癌和癌旁组织中Hiwi基因mRNA及蛋白的表达。结果肝癌组织Hiwi基因mRNA和Hiwi蛋白表达量显著高于癌旁组织(P<0.05)。Hiwi蛋白主要在肿瘤和癌旁组织细胞胞浆中呈阳性表达。肝癌组织中Hi wi阳性表达率为65.2%(60/92),显著高于癌旁组织的27.2%(25/92)(P<0.05)。结论Hiwi基因mRNA及蛋白在肝癌组织中均呈高表达,可能在肝癌的发生、发展过程中起重要作用。

利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES-hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果:人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论:成功构建重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。

人Hiwi miRNA干扰质粒的构建及其鉴定

目的构建人Hiwi基因miRNA干扰质粒,探讨其对肝癌7721细胞株中Hiwi基因和蛋白表达的阻抑作用。方法根据Homo sapiens Hiwi基因序列,设计RNA干扰靶点,构建4对Hiwi的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒并将其转染至肝癌7721细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测7721细胞中HiwimRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了4对Hiwi miRNA干扰质粒及无效干扰质粒,测序表明Hiwi干扰序列及读框完全正确。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组及阴性对照组比较,转染该载体能有效下调7721细胞株中mRNA和蛋白的表达。结论成功构建了Hiwi的干扰表达载体,为进一步探讨Hiwi基因在肝癌中的相关机制提供了实验基础。