霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

原核表达、纯化霍乱弧菌HlyA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。PCR扩增霍乱弧菌hlyA基因并克隆入pET28a、pET32a和 pCold TF载体中构建重组表达载体;将重组载体pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA转化E.coil BL21(DE3)中,进行表达条件优化及表达形式鉴定。获取可溶性形式的HlyA蛋白行Ni-NTA柱纯化,纯化的HlyA蛋白免疫BALB /c小鼠以制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测抗体效价,以评估其免疫原性。再以Western blot法分析抗体对霍乱弧菌中HlyA蛋白的特异性识别,并行质谱验证。分析纯化的HlyA蛋白的溶血活性及其抗体的中和活性。pET28a-hlyA、pET32a-hlyA载体只能诱导出包涵体表达的HlyA蛋白,pCold TF-hlyA载体诱导出可溶性表达的HlyA蛋白。经Ni-NTA柱纯化后获得较纯的HlyA蛋白,该蛋白不能裂解兔红细胞,但免疫小鼠可获得较高效价的多克隆抗体;Western blot和质谱鉴定均显示HlyA多克隆抗体能特异性识别霍乱弧菌中的HlyA蛋白,且该抗体可有效抑制霍乱弧菌分泌上清液的溶血活性。成功获得可溶表达的HlyA蛋白,免疫小鼠后获得高效价的抗HlyA多克隆抗体,为后续研究HlyA蛋白在霍乱弧菌致病过程中的作用奠定了基础。

FHA结构域蛋白TagH对霍乱弧菌肠道定植能力及致病力的影响

目的探究FHA结构域蛋白TagH对非O1/非O139群霍乱弧菌肠道定植能力和致病力的影响,并探讨这种影响是否依赖于溶血素HlyA和蛋白酶PrtV的表达。方法通过生长曲线实验测定各菌株的生长速率。取CD1乳鼠和CD1小鼠各分为PBS阴性对照组、WT菌株感染组、ΔtagH菌株感染组、ΔtagHΔhlyA菌株感染组和ΔtagHΔprtV菌株感染组,通过乳鼠肠道定植实验分析各菌株的肠道定植能力;通过小鼠灌胃感染实验测定各菌株感染组小鼠外周血白细胞数量以及IL-6、IL-8和TNF-α水平;观察各菌株感染组小鼠回肠组织病理损伤及7 d的生存情况。结果细菌生长曲线实验发现,各菌株的生长速度基本一致并无明显差异。乳鼠肠道定植实验发现,与WT菌株相比,ΔtagH菌株的肠道定植能力增强(P<0.01),ΔtagHΔhlyA菌株的肠道定植能力较ΔtagH菌株进一步增强(P<0.05),ΔtagHΔprtV菌株的肠道定植能力弱于ΔtagH菌株(P<0.05)。小鼠灌胃感染实验发现,与WT菌株相比,ΔtagH菌株的白细胞数升高(P<0.05)且肠组织损伤更严重,ΔtagHΔhlyA菌株的白细胞数较ΔtagH菌株明显下降(P<0.05)且几乎没有肠组织损伤,ΔtagHΔprtV菌株感染现象与ΔtagH菌株相似。WT菌株感染组、ΔtagH菌株感染组、ΔtagHΔhlyA菌株感染组和ΔtagHΔprtV菌株感染组的小鼠生存率分别为62.5%、75%、100%和75%。结论TagH抑制霍乱弧菌的肠道定植能力和致病力,其调控作用主要依赖于霍乱弧菌溶血素HlyA,而蛋白酶PrtV的作用不明显。

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及可溶性分析

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化。根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带。连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21(DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA。IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性。PCR扩增的hlyA基因全长约1 600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60 kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式。成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白。