霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

原核表达、纯化霍乱弧菌HlyA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。PCR扩增霍乱弧菌hlyA基因并克隆入pET28a、pET32a和 pCold TF载体中构建重组表达载体;将重组载体pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA转化E.coil BL21(DE3)中,进行表达条件优化及表达形式鉴定。获取可溶性形式的HlyA蛋白行Ni-NTA柱纯化,纯化的HlyA蛋白免疫BALB /c小鼠以制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测抗体效价,以评估其免疫原性。再以Western blot法分析抗体对霍乱弧菌中HlyA蛋白的特异性识别,并行质谱验证。分析纯化的HlyA蛋白的溶血活性及其抗体的中和活性。pET28a-hlyA、pET32a-hlyA载体只能诱导出包涵体表达的HlyA蛋白,pCold TF-hlyA载体诱导出可溶性表达的HlyA蛋白。经Ni-NTA柱纯化后获得较纯的HlyA蛋白,该蛋白不能裂解兔红细胞,但免疫小鼠可获得较高效价的多克隆抗体;Western blot和质谱鉴定均显示HlyA多克隆抗体能特异性识别霍乱弧菌中的HlyA蛋白,且该抗体可有效抑制霍乱弧菌分泌上清液的溶血活性。成功获得可溶表达的HlyA蛋白,免疫小鼠后获得高效价的抗HlyA多克隆抗体,为后续研究HlyA蛋白在霍乱弧菌致病过程中的作用奠定了基础。