赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的:克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化E.coliJM109,诱导表达HlyX;将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western blotting鉴定其免疫原性;将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。结果:扩增出1179bp的目的基因HlyX,重组质粒经双酶切、PCR鉴定,测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64kD,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1∶64000;Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组(P<0.01)。结论:HlyX能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。

赖型钩端螺旋体溶血素HlyX对血管内皮细胞通透性的影响

目的:克隆表达赖型钩端螺旋体溶血素基因hlyX,观察其表达产物对人脐静脉内皮细胞(HU-VECs)通透性的影响,并初步探讨其机制。方法:将hlyX基因插入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET-hlyX,转化大肠杆菌BL21(DH3)以高效表达携带组氨酸标签的Trx-HlyX融合蛋白,并作亲和层析纯化。采用生物素标记白蛋白的酶联免疫吸附法测定目的蛋白对HUVECs单细胞层通透性的影响,并以流式细胞术及Ho-echst 33258荧光染色方法检测其作用于HUVECs后的细胞凋亡率。结果:成功构建了重组质粒pET-hlyX并高效表达出Trx-HlyX融合蛋白;与对照组相比较,蛋白Trx-HlyX作用于HUVECs后,明显增加其通透性(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论:重组质粒pET-hlyX高效表达出Trx-HlyX融合蛋白,纯化后的融合蛋白对HUVECs通透性有影响,且对HUVECs具有细胞毒性作用。

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒，并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法以赖型钩端螺旋体全基因组为模板，PCR扩增出目的基因HlyX，以质粒pcDNA3．1为载体，双酶切构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒。将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达。将重组质粒免疫BALB／c小鼠，每两周1次，共3次，ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平。结果扩增出全长约1100bp的HlyX基因，重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功。RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100bp的目的基因片段，Western blot分析可见在相对分子质量（Mr）40×10^3左右出现特异性的目的条带。DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平（1：6561～1：19683）。结论赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体，为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。