华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠羧酸酯酶基因HoCL1的克隆与序列分析

利用粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)围食膜蛋白多克隆抗体,从已构建的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库中筛选得到1个编码羧酸酯酶的cDNA克隆HoCL1,其开放阅读框(ORF)长1 599 bp,编码532个氨基酸,推导的蛋白质分子质量为59.5 kDa,等电点(pI)为4.5。HoCL1蛋白具有羧酸酯酶的保守结构域:1个二硫键形成的位点和1个丝氨酸活性中心,三联体催化活性中心位于Ser207、Asp333和His422上,不含有氮联糖基化位点和氧联糖基化位点,只含有3个半胱氨酸残基。依据氨基酸序列同源性分析和保守结构域分析,HoCL1属于B类酯酶,与赤拟谷盗Tribolium castaneum羧酸酯酶相似性最高,为35.2%。通过与其他昆虫羧酸酯酶序列比对及构建系统发育树,发现HoCL1羧基端的氨基酸序列保守性低,但靠近N端的活性中心处的氨基酸序列则高度保守,可与赤拟谷盗、异色瓢虫Harmonia axyridis羧酸酯酶聚类在一起。羧酸酯酶HoCL1基因的克隆鉴定为进一步研究该基因在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能奠定了基础。

Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫(Holotrichia oblita)中肠微生物菌群的影响

Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫有特异的杀虫活性,通过中肠微生物宏基因组分析研究了Bt Cry8Ea蛋白与华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物的相互作用。解剖正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita二龄幼虫中肠,提取中肠微生物宏基因组DNA,构建16S rDNA文库。利用PCR-RFLP方法分析两个处理中肠微生物16S rDNA酶切片段多态性(MspⅠ,RsaⅠ和HaeⅢ内切酶),不同克隆测序后与NCBI数据库进行对比分析,构建系统进化树,确定中肠微生物种属。结果显示,正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物共检出30种细菌,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria):(Desulfosporosinus,29.63%);厚壁菌门(Firmicutes):梭菌属(Clostridium,12.59%)和芽孢杆菌属(Bacillus,10.37%),而饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃幼虫中共检出4种细菌,优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes):肠球菌属(Enterococcus,50%)和链球菌属(Streptococcus,46.88%)。结果表明,饲喂Cry8Ea蛋白后,中肠微生物的菌群结构发生了明显变化。

华北大黑鳃金龟生物钟基因HoPer的克隆和表达模式分析

为明确华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita周期蛋白基因(Period,Per)的表达模式,本研究采用RACE技术从2龄幼虫中克隆到生物钟基因HoPer,并进行生物信息学分析;再采用RT-qPCR技术检测HoPer在不同发育阶段、雌雄成虫不同组织以及不同光周期下的表达水平。结果表明:HoPer编码1 172个氨基酸,蛋白分子量129.67 kDa,等电点为5.62。HoPer推导出的氨基酸序列中具有2个PAS和1个Period C结构域,是昆虫PER蛋白的典型结构特征。表达模式分析得出:HoPer在各个发育阶段均有表达,但在卵中的表达量显著高于其他发育时期;HoPer在雌雄成虫的头和触角中表达水平最高,其次为翅和足,在胸和腹中表达水平最低;雌雄成虫中HoPer在试验设定的5个光周期中未发现明显的表达差异。本研究为进一步阐明华北大黑鳃金龟HoPer基因功能以及其在生物钟网络中的调控作用提供了一定的参考。

金龟子绿僵菌对华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性研究

虫生真菌是害虫的重要天敌之一。从华北大黑鳃金龟幼虫Holotrichia oblita(Fald.)分离出一株真菌,并采用浸渍法初步研究了对华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明,分离出的虫生真菌为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株;随金龟子绿僵菌孢子浓度的升高,华北大黑鳃金龟幼虫的感病死亡率增加,在孢子浓度为2.1×104、1.9×105、2.2×106、2.0×107、1.8×108个/ml时,幼虫的累计死亡率分别为20%、65%、90%、100%和100%。用时间-剂量-死亡率模型(time-dose-mortality model,TDM)对幼虫的致病力数据进行模拟,所建模型均顺利通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验,表明模型拟合良好,并由模型估计出了该菌株对华北大黑鳃金龟幼虫的致死剂量与致死时间。结果说明该菌株对防治华北大黑鳃金龟幼虫具有较强的应用潜力。

营养和湿度对华北大黑鳃金龟生长发育和生殖的影响

以华北大黑鳃金龟为对象,研究了营养和湿度对其发育和生殖的影响。在室内条件下,以不同饲料饲养成虫,取食榆树叶的华北大黑鳃金龟产卵量最高,为107.1粒/头,其次是毛白杨叶,而取食玉米叶和刺槐叶的产卵量最低。在马铃薯块、甘薯块和花生米三种饲料中幼虫最嗜取食马铃薯块,且存活率最高,幼虫重量显著高于取食甘薯块和花生米的幼虫重量。土壤湿度对卵发育影响较大,土壤湿度为18%时,卵的孵化率最高为75.6%,过干过湿都不利于卵的孵化。以含有15.7 mg/cm^2水的滤纸在暗处培育卵,孵化率可达77.7%,这种卵的孵育方法操作简便,减少了土壤中病原微生物和土壤颗粒对卵的侵染及损伤。土壤湿度为15%-18%时最有利于幼虫的生长发育,高于或低于这一湿度,幼虫的死亡率均增加。饲养中发现,幼虫在低龄阶段死亡率最高,尤其在初孵幼虫生长发育的前30 d内,这可能与低龄幼虫体壁较薄,抵抗过干过湿以及物理损伤的能力较差有关。

昆虫病原线虫对大豆地下害虫东北大黑鳃金龟幼虫的致病力研究

蛴螬是一种对大豆为害严重的地下害虫。本试验应用昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematode,EPN)斯氏线虫Steinernema carpocapsae的4个品系和异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora的3个品系,分别以滤纸和沙子为介质对东北大黑鳃金龟幼虫进行致病力测定,筛选出异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora-1品系为防治东北大黑鳃金龟幼虫的较理想线虫品系,以沙子为介质时,校正寄生死亡率达95.83%。

蓖麻叶对华北大黑鳃金龟引诱作用的研究

利用嗅觉仪、触角电位仪、田间笼罩试验等方法测定了蓖麻叶对华北大黑鳃金龟的引诱作用.结果表明,在嗅觉仪中,华北大黑鳃金龟对蓖麻叶粗提物的选择性显著大于其他11种供试寄主植物,在田间选择性试验中,华北大黑鳃金龟对蓖麻的选择性也显著大于其他供试植物,表明蓖麻叶片中存在具有诱虫活性的气味物质.研究还发现,蓖麻叶对大黑鳃金龟有麻痹作用,但无直接致死作用.

华北大黑鳃金龟对20种植物源挥发物的电生理和行为反应

[目的]发掘能影响华北大黑鳃金龟行为反应的植物挥发性物质,以利用化学生态学技术调控华北大黑鳃金龟的行为,达到绿色防控的目的。[方法]采用触角电位(EAG)及Y型嗅觉仪行为测定技术,对20种植物挥发物进行筛选。[结果]在10μg/μL浓度刺激下,顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯、辛醛和苯乙醇能引起华北大黑鳃金龟触角较强的电位反应,总体趋势雌虫反应大于雄虫。行为测试中,反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸顺-3-己烯酯、1-己醇、邻氨基苯甲酸甲酯吸引能力都显著高于对照正己烷,但辛醛和苯乙醇对华北大黑鳃金龟的吸引作用低于对照正己烷,并呈极显著差异(p<0.01)。[结论]华北大黑鳃金龟对本文所选的部分植物源挥发物对有显著的电生理和行为反应,该结果可为开发对其的田间引诱剂或驱避剂提供一定的理论依据。

鞘翅目害虫-华北大黑鳃金龟围食膜结构的初步研究

应用光学显微镜和生化技术，研究了华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）围食膜的基本结构和表面形态，初步分析了围食膜蛋白质的种类，蛋白质和糖的含量，测定了棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白对围食膜结构的影响。结果表明，华北大黑鳃金龟围食膜表面平滑致密，富有弹性，但与多数昆虫围食膜相比韧性较差，主要由蛋白质、糖和几丁质组成，其中蛋白质的含量约为36．25％，糖的含量约为8．91％，其他为几丁质等；经SDS—PAGE测定，围食膜的蛋白质种类较多，有28条多肽比较清晰，分子量多在17．6—320．3kDa。棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白不能降解华北大黑鳃金龟围食膜中的蛋白质。

东北大黑鳃金龟对绿叶气味的触角电位及行为反应

利用触角电位(electroantennogram,简称EAG)技术和风洞试验,测试了东北大黑鳃金龟成虫对两种绿叶气味——反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇的电生理和行为反应:雌雄金龟子对两种气味都能产生EAG反应,其反应强度随着剂量的增加而增强,且对5-甲基-1-己醇的反应强度略高于对反-2-己烯醛的反应强度;雌虫对这些气味的EAG灵敏度高于雄虫。光周期不影响雌雄两性对这些绿叶气味的EAG反应。行为测试结果显示,反-2-己烯醛对成虫具有定向作用,5-甲基-1-己醇对成虫无显著的行为作用。

18种杀虫剂对华北大黑鳃金龟和铜绿丽金龟的毒力比较

采用浸渍法,测定了18种杀虫剂对华北大黑鳃金龟和铜绿丽金龟2龄幼虫的室内毒力,并比较了供试杀虫剂对两种试虫的毒力差异。结果表明,氨基甲酸酯类杀虫剂和大多数有机磷杀虫剂对两种金龟子幼虫的毒力差异较小,其它各类杀虫剂对铜绿丽金龟的毒力显著高于对华北大黑鳃金龟的毒力。其中新烟碱类药剂对两种试虫毒力差异最大,如啶虫脒对铜绿丽金龟的毒力高于华北大黑鳃金龟159.61倍,另外,苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈对两种试虫毒力也相差了85.73倍。

土壤含水量对华北大黑鳃金龟生长发育的影响

室内试验研究土壤含水量对华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann生长发育的影响。结果表明,土壤含水量对华北大黑鳃金龟的影响因其发育阶段的不同而异。卵期适宜土壤含水量为10%～20%,幼虫期、蛹期适宜土壤含水量分别为10%～15%和15%～20%。土壤含水量为10%～15%时,成虫性比接近1∶1。土壤含水量为15%时,世代存活率最高。

大黑蛴螬活动规律及对农作物幼苗的取食趋性研究

研究了不同龄期大黑鳃金龟Holotrichia oblita幼虫(蛴螬)的活动规律及其对6种农作物幼苗根部的取食趋性。大黑蛴螬的活动规律结果表明:各龄期大黑蛴螬均易趋向于幼苗根部寻找食物。采用双因素方差分析法研究取食时间和幼苗种类对大黑蛴螬取食趋性的影响。结果显示:除二龄外,一、三龄大黑蛴螬3 d后和6 d后在幼苗根部的虫量没有显著性差异;而在不同幼苗根部,各龄期大黑蛴螬的虫量均存在显著性差异。

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶,为了了解该类酶的分子特性及功能,本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库,首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列,命名为HoSP1(GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明,该基因长902bp,开放阅读框(ORF)长783bp,编码260个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.7kDa和4.19,不含有N-糖基化位点,但在Thr157处有一个O-糖基化位点,含有6个保守的半胱氨酸残基,组成3对二硫键,对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现,该酶具有组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)催化中心,与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性,其中与CzSP3的序列一致性最高,为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后,进行体外表达,以BTEE为底物,测得该酶的活力为0.0378μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。

Cry8Ga1蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫主要酶活性的影响

华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita(Faldermann)]是一种危害严重的地下害虫,Cry8Ga1蛋白对其幼虫具有明显杀虫活性。本文比较了华北大黑鳃金龟幼虫取食Cry8Ga1蛋白后6种酶活性的变化,发现取食高浓度(5×LC50,50.767μg/g土)Cry8Ga1蛋白幼虫的总蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)以及氨肽酶(APN)的活性较对照均有不同程度的升高,在大多数处理时段差异显著(P<0.05),其中高浓度处理组的GST酶活性在12h后升高倍数最大,是同时段对照的23.37倍;而取食低浓度(0.5×LC50,5.076 7μg/g土)Cry8Ga1蛋白时,乙酰胆碱酯酶和氨肽酶活性无明显差异(P≥0.05)。类胰蛋白酶在整个试验中活性变化与对照相比仅有个别处理时段存在差异,由此推断,类胰蛋白酶不是华北大黑鳃金龟幼虫对Cry8Ga1蛋白的主要活化酶。

华北大黑鳃金龟两种围食膜蛋白cDNA的分子克隆与序列分析

6本文以华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠为材料,依据Stratagene公司文库构建试剂盒方法,构建其中肠cDNA表达文库,该文库滴度为1.9×106pfu/mL,重组率为99.97%。依据现代免疫学原理,利用棉铃虫Helicoverpaarmigera围食膜蛋白多克隆抗体筛选文库,得到两个编码华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的cDNA克隆Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2,其cDNA长分别为2385bp和1633bp,在polyA末端上游各有3个多聚腺苷酸信号序列AATAAA,最长开放阅读框(ORF)分别编码729个和477个氨基酸,与粉纹夜蛾Trichoplusia niCBP2(chitin bindingprotein2)的相似性最高,分别为21.9%和19.1%。结构域分析表明,Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2分别具有9个和6个几丁质结合功能域,只含有较少的O-糖基化位点,不含有类粘蛋白结构域。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对两种蛋白的作用位点主要位于几丁质结合功能域(chitin binding domain,CBD)内部,而因受几丁质结合功能域保护,这两种蛋白能够抵抗这些蛋白酶的降解。与正常CBD比较,这两种蛋白C端的CBD只含有4个Cys,只在第1与第3、第4与第5个Cys之间形成两对二硫键,缺少由第2与第6个Cys形成的二硫键。推测其N端还应包括信号肽序列和几丁质结合功能域的未知序列。

华北大黑鳃金龟气味受体OrCo基因的克隆及序列分析

嗅觉受体OrCo(olfactory receptor coreceptor)在不同昆虫体内高度保守,克隆华北大黑鳃金龟[Holotrichiaoblita(Falderman)]OrCo基因可以为进一步探索受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法,克隆获得华北大黑鳃金龟OrCo受体基因cDNA全长序列。将该基因命名为Hobl/Or-Co。序列分析结果显示,Hobl/OrCo全长共1 598bp,开放阅读框全长1 434bp,编码477个氨基酸,序列中有7个跨膜区和高度保守的C端区域。Hobl/OrCo基因的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟嗅觉受体的同源性高达95.39%,与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性在76%以上,特别是在C端几乎完全一致。

华北大黑鳃金龟幼虫血细胞的超微结构观察

应用光学和电子显微镜技术检查了华北大黑鳃金龟3龄幼虫血淋巴内的血细胞,识别出5种类型的血细胞(原血胞、浆血胞、颗粒血胞、珠血胞和凝血胞)并对每一种血细胞的超微结构特点进行描述。

华北大黑鳃金龟成虫周年发生动态及影响因素分析

华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita(Faldermann)]是一种为害多种作物的重要地下害虫,为了解其近年的发生动态以便针对性防治,于2010-2013年对其成虫出土规律进行了周年系统研究,并对其发生期和发生量影响因素进行了初步分析。结果表明,2010-2013年华北大黑鳃金龟的出土盛期仍在5月份,与文献相比总体一致,但出土期略滞后并且时间有所延长;而2013年始发期明显晚于其他年份,对其气象因素分析发现,2013年春季干旱,首次降雨在5月26日,明显晚于其他年份,其始发期也较其他年份偏晚,说明土壤湿度可能影响成虫出土始期。出土盛期成虫出土量与气象因素的灰色关联度分析表明,成虫日出土量与平均相对湿度关联最密切,其次是日均温和降雨量。研究结果为华北大黑鳃金龟的预测预报以及针对性防治提供了基础。

草坪害虫华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白Ho-Peritrophin3基因克隆及序列分析

华北大黑鳃金龟是一种重要的草坪害虫,其幼虫中肠围食膜是害虫生物防治的潜在靶标。本研究利用棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,从已构建的华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库中筛选得到一个编码围食膜蛋白的cDNA克隆Ho-Peritrophin3,其cDNA长度为1 737 bp,在polyA末端上游含有1个多聚腺苷酸信号序列AATA-AA,最长开放阅读框(ORF)编码528个氨基酸,与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白Ho-Peritrophin2的相似性最高,为64.9%。结构域分析表明,Ho-Peritrophin3只含有较少的O-糖基化位点和N-糖基化位点,不含有类粘蛋白结构域,具有5个几丁质结合功能域(chitin binding domain,CBD),它们均由6个保守的半胱氨酸残基组成,与Ho-Per-itrophin1、Ho-Peritrophin2羧基端的CBD只含有4个半胱氨酸残基明显不同。Ho-Peritrophin3的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点主要位于5个CBD内部,受到其保护,不会被降解;与Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2不同的是在第5个CBD下游区域的107个氨基酸中,有36.3%的氨基酸属于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。