中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症PCR-RFLP检测方法的研究

本试验根据已知牛染色体上CD18编码基因序列设计引物,提取牛血液和精液DNA,可扩增出338bp的DNA片段,将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,对阳性重组质粒进行测序,确定为牛的CD18基因。由于CD18基因的383位碱基由A变为G,而引起牛白细胞黏附缺陷症(BLAD),通过对济南市11个奶牛场356头奶牛及53头荷斯坦种公牛进行了BLAD的PCR-RFLP检测,共检出3头杂合母牛(携带者),占检测母牛群的0.84%,在荷斯坦公牛中只检测到一种基因型,没有发现隐性突变基因的携带者。

中国荷斯坦牛与务川黑牛TLR_(5)基因SNPs及序列特征分析

为了筛查牛Toll样受体家族(toll-like receptors,TLRs)基因TLR_(5)的单核苷酸多态性(SNPs)位点,试验采用DNA混合池扩增后直接测序的方法对中国荷斯坦牛和务川黑牛8个外显子SNPs位点进行检测,并估算SNPs位点的等位基因频率,同时利用生物信息学分析方法对TLR_(5)基因的mRNA二级结构、氨基酸理化性质、编码蛋白质的亲/疏水性、蛋白质二级和三级结构进行预测与分析。结果表明:中国荷斯坦牛和务川黑牛TLR_(5)基因上共有5个SNPs位点,分别为g(N).T^(1850)C、g(N).G^(2549)A、g(W).T^(1850)C、g(W).G^(2297)C、g(W).G^(2549)A,其中g(N).T^(1850)C、g(W).T^(1850)C位点为错义突变,均导致氨基酸由亮氨酸变为丝氨酸,其余为同义突变。TLR_(5)基因错义突变位点g(N).T^(1850)C和g(W).T^(1850)C的mRNA二级结构自由能增加,均为-3593.55 kJ/mol,增加了mRNA二级结构的稳定性;而同义突变位点中仅g(W).G^(2297)C的mRNA二级结构的自由能略减少,为-3574.14 kJ/mol,降低了mRNA二级结构的稳定性。中国荷斯坦牛和务川黑牛TLR_(5)基因均编码909个氨基酸,均表现为编码的丝氨酸占比最多,编码氨基酸的不稳定指数均大于40,平均亲/疏水性分值为0.064分和0.067分,编码的蛋白质是不溶性蛋白质,二级结构中均为无规则卷曲占主导地位,三级结构突变前后均没有发生明显变化。说明TLR_(5)基因的突变可能与奶牛乳房炎相关,其突变位点有可能成为中国荷斯坦牛和务川黑牛乳用性状选育的分子标记。

牛朊蛋白(bPrP^C)基因的克隆和序列分析

分别从9头牛(3头牦牛、3头荷斯坦牛和3头秦川黄牛)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的牛PrPC的片段大小为795bp,包含了牛朊蛋白基因的完整编码区序列,为含单一外显子的完整开放阅读框,与国内外报道的已知序列基本相同。本次所报道的牛PrP(bPrPC)基因含6个短而富含G-C的元件,可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln/Arg或九肽Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp/Arg-Gly-Gln。这些bPrPC基因序列相比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别在99.0%～100.0%和99.2%～100.0%之间。在整个18个碱基替换中,多数替换是保守的,为同义突变,仅有5个替换引起氨基酸突变,分别为HN200302的W60R、HN200303的S154N、MN200301的A129V、NN200302的Q234R和NN200303的Q94R突变。发现牦牛朊粒基因在126(A→G)、234(G→A)和678(T→C)位的特征性核苷酸替换,但均为同义码替换。

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.

中国荷斯坦奶牛铁蛋白基因3′端克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析中国荷斯坦奶牛的铁蛋白(FTH)基因,为该基因的功能研究和有效利用提供理论依据。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从公犊肝脏组织中扩增出FTH基因的3′端cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行分析。结果表明,FTH基因3′端cDNA全长为489bp,编码81个氨基酸;经生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白无N端信号肽及跨膜区,相对分子质量为9.125 3kD,理论等电点为5.19,脂肪系数为85.56,总亲水性为-0.342,其一级结构中存在4个功能结构域;二级结构元件以α-螺旋和β-旋转为主;同源序列分析表明,中国荷斯坦奶牛与原牛FTH氨基酸的相似性最高(99%);系统进化树显示,在该基因座位上中国荷斯坦奶牛与所测物种的亲缘关系均较远。本研究有助于揭示FTH家族基因的进化历史,为对其进行深入的功能分析和利用研究提供参考。

奶牛DQA2基因序列特征分析

为了获得荷斯坦牛DQA2基因序列并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,通过DNAstar软件和在线服务器预测中国荷斯坦牛DQA2基因CDS区编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、糖基化位点、信号肽、跨膜结构、二级结构以及三级结构。结果表明,中国荷斯坦牛DQA2基因CDS区长度为765bp,编码254个氨基酸,蛋白结构预测是一种混合型的可溶性蛋白质,具有4个潜在的N-糖基化位点,分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369;在第1~23位氨基酸之间存在信号肽;存在1个典型的跨膜螺旋区,氨基酸序号为217-239。本研究结果为进一步研究荷斯坦牛的抗病育种提供了理论基础。