Homer1b/c“支架”在CTNND2-/-自闭症模型鼠中的作用研究

目的:观察CTNND2-/-自闭症模型鼠前额叶皮层中支架蛋白荷马1b/c(homer protein homolog 1b and 1c,Homer1b/c)与三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)、代谢型谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)和香克3蛋白(sh3 and multiple ankyrin repeat domains 3,Shank3)蛋白相关复合体的变化;前额叶皮层中常见氨基酸的变化,发现自闭症模型鼠中可能参与疾病发生的关键靶点。方法:蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)法检测CTNND2-/-自闭症模型鼠前额叶皮层中支架蛋白Homer1b/c、突触后密度蛋白-95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)、突触素蛋白(synaptophysin,SYP)、囊泡谷氨酸转运体1(vesicular glutamate transporter 1,vGluT1)的表达的变化;通过免疫荧光(immunofluorescence,IF)观察Homer1b/c与IP3R、mGluR5和Shank3蛋白的表达与共定位;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)技术分别观察Homer1b/c与IP3R、mGluR5或Shank3结合的变化;使用液相色谱(liquid chromatography,LC)观察前额叶皮层中常见氨基酸的变化。结果:与对照组相比,CTNND2-/-模型鼠前额叶皮层中Homer1b/c(P=0.003)、PSD-95(P=0.003)以及SYP蛋白(P=0.046)的表达均明显降低;同时,Homer1b/c与IP3R、mGluR5、Shank3蛋白相互之间结合减少;前额叶皮层中常见的兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate,Glu)和抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的表达无明显变化(P=0.366,P=0.355),组氨酸(histidine,His)(P=0.036),酪氨酸(tyrosine,Tyr)(P=0.030)表达则明显增高。结论:CTNND2-/-自闭症模型鼠中Homer1b/c蛋白低表达,同时Homer1b/c与IP3R、Shank3、mGluR5蛋白复合物的形成减少,并推测低表达的Homer1b/c可能是导致自闭症神经元突触异常发育的关键靶点。

臭氧抑制慢性压迫性坐骨神经损伤模型小鼠的脊髓Homer1b/c对神经病理性疼痛的影响

目的研究臭氧对慢性压迫性坐骨神经损伤(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型小鼠疼痛的影响,探讨CCI模型小鼠脊髓Homer1b/c在此过程中的作用。方法按随机数字表法将62只雄性昆明小鼠分为8组(每组8只):假手术组(S1组)、注射纯氧对照组(S2组)、CCI术后第7天组(C1组)、CCI术后第13天组(C2组)、术后第7天注射臭氧组(O1组)、术后第7~13天注射臭氧组(O2组)、鞘内注射反义寡核苷酸组(AS组)、鞘内注射生理盐水对照组(NS组)。各组小鼠均选择左侧坐骨神经建立CCI模型,术后7 d小鼠出现左后肢负重减少、挛缩等体征,且无肢体瘫痪、自噬等现象视为建立模型成功。术后第7天开始观测机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足潜伏期(thermal withdraw latency,TWL),Western blot法检测脊髓Homer1b/c和代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor,mGluR)5表达水平,免疫荧光法检测Homer1b/c和mGluR5在脊髓的分布与表达。S1组只游离神经不结扎,术后第7天观测MWT和TWL;S2组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,在术后第7天注射纯氧2、4、8、24 h后观测MWT;C1组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,术后第7天观测MWT和TWL,其中MWT观测时间点同O1组;C2组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,术后第7~13天观测MWT和TWL;O1组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,在术后第7天注射臭氧,观测注射后2、4、8、24 h的MWT和注射后2 h的TWL;O2组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,在术后第7~13天每天注射臭氧2 h后观测MWT;AS组行左侧坐骨神经结扎,逐层缝合,在术后第4天起鞘内注射Homer1b/c的反义寡核苷酸至第7天,术后第4~9天观测MWT;NS组为AS组的生理盐水对照组,与AS组相同时间点观测MWT。结果与S1组比较,C1和C2组小鼠MWT及TWL均降低(P<0.05);与C1组比较,O1组小鼠MWT升高(P<0.05),而TWL差异无统计学意义(P>0.05);与C1组比较,O1组小鼠MWT在注射臭氧2、4 h后升高(P<0.05),S2组小鼠MWT差异无统计学意义(P>0.05);与C2组比较,O2组小鼠MWT升高(P<0.05);与NS组比较,AS组小鼠MWT在术后第8、9天显著升高(P<0.05)。与S1组比较,C2组和O2组小鼠Homer1b/c表达水平升高(P<0.05);与C2组比较,O2组小鼠Homer1b/c表达水平降低(P<0.05);S1组、C2组、O2组小鼠的mGluR5表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与S1组比较,NS组和AS组小鼠Hom‑er1b/c表达水平升高(P<0.05);与NS组比较,AS组小鼠Homer1b/c表达水平降低(P<0.05)。与S1组比较,C1组小鼠Homer1b/c的表达增多;与C1组比较,O2组、AS组小鼠Homer1b/c表达减少;S1组、C1组、O2组和AS组小鼠的mGluR5表达未见明显差异。双重染色融合后,与S1组比较,C1组小鼠Homer1b/c表达位置与mGluR5的位置相近;与C1组比较,O2组和AS组小鼠Homer1b/c表达位置与mGluR5相近的结果减少。结论臭氧可以抑制CCI模型小鼠的机械痛敏,其机制可能是抑制Hom‑er1b/c的产生,减少与mGluR5的相互作用。

Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的保护作用研究

目的:探讨Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的作用。方法:构建pc DNA3.1-Homer1b/c质粒和Homer1b/c si RNA,过表达及si RNA干扰Neuro-2a细胞中Homer1b/c的水平,western blot分析观察上调及下调Homer1b/c后Homer1b/c的蛋白表达变化,再予细胞缺氧复氧损伤处理,观察细胞生存率、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放量及caspase-3活性的变化。结果:过表达及si RNA干扰Homer1b/c后,Homer1b/c的蛋白水平分别较正常组明显增高及降低(P值分别<0.01),提示过表达及干扰Homer1b/c的效果均明显,分别能明显提高及降低Homer1b/c的水平。在缺氧复氧损伤条件下,Homer1b/c过表达组较空质粒转染组,其细胞生存率明显增加,LDH释放量、caspase-3活性明显降低(P值分别<0.05);相反,下调Homer1b/c的水平后,与control si RNA转染组相比,细胞生存率明显降低,而LDH释放量和caspase-3活性明显增加(P值分别<0.05)。结论:Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中具有神经保护作用。

发育期铅暴露对仔鼠海马Homer表达和学习记忆影响

目的探讨发育期慢性低浓度铅暴露对仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达变化与学习记忆能力的关系。方法 30只孕鼠按体重随机分为3组,分别给予双蒸水(对照组)、0.05%、0.20%醋酸铅饮水(低、高剂量染铅组),断乳后仔鼠自行饮用含铅水至生后28 d,生后56 d采用跳台试验测试仔鼠学习记忆能力;Western blot法检测仔鼠生后7、14、21、28 d海马Homer1b/c蛋白表达;血铅和海马脑铅含量用原子吸收光谱法测定。结果对照组、0.05%、0.20%醋酸铅组仔鼠跳台试验逃离潜伏期分别为(25.71±4.56)、(39.67±5.18)、(64.82±9.73)s,停留潜伏期分别为(234.89±25.85)、(147.15±19.26)、(83.56±14.52)s,与对照组比较,各剂量染铅组仔鼠逃离潜伏期明显延长、停留潜伏期明显缩短(P<0.05);与对照组比较,生后7、14、21、28 d时,0.05%和0.20%醋酸铅组仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达分别为(0.607±0.022)、(0.825±0.054)、(0.583±0.015)、(0.557±0.011)和(0.540±0.021)、(0.574±0.018)、(0.471±0.009)、(0.412±0.007)明显降低(P<0.05)。结论慢性铅暴露可降低仔鼠被动回避反应的学习和记忆能力,其机制可能与染铅所致仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达下降有关。