菜心cDNA-AFLP分析体系的优化与建立

以菜心的顶端分生组织为试材,对影响菜心cDNA-AFLP体系的关键因子进行了探讨,以期建立适于菜心转录组差异表达的cDNA-AFLP分析体系。结果表明:Trizol法适用于菜心总RNA提取;SMART双链cDNA合成法效率较高,其中第二链cDNA合成的最佳循环数为24个;Taq I/Ase I分步各酶切3 h可使双链cDNA酶切完全;预扩增体系以模板稀释20倍,27个循环扩增效果较好,退火温度对扩增结果影响不大,但Mg2+对PCR扩增影响较大,经比较加入2.5μL Mg2+(25 mmoL/L)的预扩及选扩电泳的效果均最佳;预扩产物稀释20倍用于选择性扩增,其PAGE电泳可以获得丰富且重复性好的带型。cDNA-AFLP分析体系的优化与建立为菜心抽薹开花分子机理进一步研究奠定了基础。

NaCl胁迫对不同生育期红菜薹的影响

研究了NaCl胁迫对不同生育时期红菜薹[Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.utilis Tsen et Lee]的影响。结果表明,在种子萌发期,300 mmol/L的NaCl处理显著降低了红菜薹种子的发芽率、发芽势和发芽指数;在幼苗期,不同浓度的NaCl处理对红菜薹的地上部鲜重、根鲜重、根干重、丙二醛含量、根系活力均无显著影响,在300 mmol/L的NaCl胁迫下红菜薹的地上部干重反而显著增加;在成株期,不同浓度的NaCl处理对红菜薹的叶片数、主薹高度、主薹茎粗、侧薹数、单株产量、丙二醛含量、根系活力均无显著影响。

正交设计优化菜薹ISSR反应体系研究

菜薹原产中国,是华南地区重要的特产蔬菜之一。目前,分子标记技术已广泛应用于多种作物研究,但在菜薹上的应用研究刚刚起步。ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,其反应条件受模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物等因素的影响。正交试验设计能明确各因素间的互作效应,建立最优化的反应体系。本研究利用正交试验设计,从Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、Mg2+4种因素3个水平对菜薹ISSR反应体系进行了优化,确立了适合菜薹的ISSR反应体系并在7个菜薹品种中进行了验证。在20μl反应体系中,含Taq DNA聚合酶1U、dNTP250μmol/L、引物0.25μmol/L、1×PCRbuffer、Mg2+2.5mmol/L、模板DNA30ng。通过梯度PCR测验,确定了适宜的退火温度。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行菜薹种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。

菜薹细胞质不育系小孢子发生的细胞形态学研究

菜薹雄性不育系小孢子发生的细胞形态学观察表明，孢原细胞分化期之前败育的花占５９．６％，不形成花粉囊；有花粉囊发育的花占４０．４％，其中绝大多数花中只有一个雄蕊能形成一个体积很小的花粉囊，雄性不育系小孢子发育在小孢子母细胞期、四分体及单核小孢子期均有败育，败育方式有绒毡层细胞异常肥大，挤压小孢子母细胞；减数分裂异常，无胞质分裂而形成巨细胞；单核小孢子粘连成花粉块，异常膨大等。还有雄蕊雌蕊化等花器异常现象。

高温胁迫对不同耐热性菜心材料生理特性的差异研究

以4个耐热性存在差异的菜心品种(系)为试材,研究持续高温胁迫对菜心叶片中渗透调节物质、电解质渗漏率、活性氧的产生与清除的影响。结果表明:短期(1d)高温胁迫下,除过氧化氢酶(CAT)酶活性在耐热性弱的菜心材料中急剧增加,且达到活力最高值外,其它性状如脯氨酸和甜菜碱含量、电解质渗漏率、丙二醛(MDA)含量、O2.产生速率、H2O2含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)酶活性出现小幅度增加,且这些性状的值在4个菜心材料间差异不大;随着高温胁迫处理时间的延长(3～7d),生理指标在4个材料中呈现不同程度的增加,表现出耐热性强的材料的甜菜碱含量、SOD、POD和CAT酶活性均明显高于耐热性弱的材料,电解质渗漏率、MDA含量、O2.产生速率、H2O2含量则明显低于耐热性弱的材料;而脯氨酸含量的高低则未表现出与菜心耐热性强弱的对应关系。

菜心SOD基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得3个SOD基因,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR分析3个基因在不同组织器官和低温胁迫下的表达模式。结果表明:(1)获得Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD基因的ORF,分别命名为BclCZSD、BclFSD、BclMSD,序列长分别为459、639、696bp,分别编码152、212、231个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,3种蛋白均为稳定的亲水性蛋白,均不存在跨膜结构和信号肽,BclCZSD的二级结构以无规则卷曲为主,含有2个Cu/Zn-SOD结构域,BclFSD和BclMSD的二级结构以α-螺旋为主,含有一个相同的Mn/Fe-SOD结构域;进化分析显示BclCZSD和BclMSD与油菜最先聚在一个分支,BclFSD与甘蓝、萝卜、油菜、芜菁聚在一个分支。(3)qRT-PCR结果显示,BclCZSD、BclFSD和BclMSD基因在菜心根、茎、叶和叶柄中均有表达,且在根、茎、叶和叶柄中的表达模式不完全相同;低温条件下,3个基因的表达量随着胁迫时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势。研究结果为进一步探讨菜心SOD基因在低温胁迫下的响应机制奠定了基础。

菜薹雄性不育相关基因的ISSR分子标记筛选

菜薹(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var.utilis Tsenet Lee)属于十字花科芸薹属,原产中国,是华南地区重要的特产蔬菜之一。利用分子标记技术进行菜薹雄性不育相关基因的定位对菜薹品质创新和选育新品种具有重要意义。目前尚未见有利用ISSR分子标记技术进行菜薹雄性不育分析的研究报道。利用ISSR技术对菜薹雄性不育系及其保持系的基因组DNA进行比较分析;结果显示100个ISSR引物中,只有引物UBC843的扩增结果在两系之间表现出了差异性,找到了不育系和保持系间的特异扩增片段。回收该特异扩增片段并进行克隆测序,测序结果表明该片段全长为462bp。与白菜其它育性相关序列比较,同源性均低于50%。根据测序结果设计了一对特异引物,将其转化为更稳定的SCAR标记。经F2群体验证,ISSR引物扩增得到的特异片段很有可能来自核DNA。

菜薹抽薹性状的ISSR和SRAP分析

以早抽薹品种CT07和晚抽薹品种T0601为亲本构建F2分离群体,采用分离集团混合分析法(Bulkedsegregant analysis,BSA)筛选与菜薹抽薹基因连锁的分子标记。用45条ISSR(Inter-simple sequence repeat,简单重复序列间扩增)引物和20对SRAP(Sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)引物组合进行PCR扩增筛选,其中UBC834、UBC876、E13M4和E5M7对亲本和DNA池的扩增图谱表明,4个引物的差异条带均出现在早抽薹品种CT07和早现蕾(抽薹)池中。经F2代群体单株验证,4个标记均与早抽薹基因相连锁,且标记E13M4最近,距离为16.8 cM,这为菜薹抽薹基因的定位和分子标记辅助育种奠定了基础。

菜薹(菜心)生长动态与花茎形成

早熟品种四九菜心与中熟品种60天特青菜心两个播期试验表明,早熟品种与中熟品种的生育过程略有不同,但两者鲜质量和干质量增长,叶片与叶面积都逐步增加,净同化率也逐步提高,以花薹形成期增长最多,净同化率较高;生育过程中干物质分配以叶片生长占大部分,至花茎形成时仍占一部分,菜薹占的干物质比例则逐渐增加,采收时占植株干物质的40%～50%.

尿素配施氯化铵对菜薹硝酸盐积累的影响

利用盆栽试验研究尿素配施不同比例的氯化铵对菜薹(菜心)硝酸盐积累的影响,结果表明:氯化铵能显著减少栽培基质中亚硝酸细菌的数量,抑制硝化作用的进行。尿素与氯化铵配合施用能显著降低菜心硝酸盐含量,降低效应随着配施氯化铵比例的增加而增加。

不同土壤类型对红菜薹品质的影响

为摸清历史上与洪山区同属武昌县的江夏区种植洪山菜薹的可行性,在位于江夏区法泗镇的公司甲、位于江夏区郑店街的公司乙、洪山菜薹原产地进行了不同土壤类型种植洪山菜薹品质对比试验。对6个不同土壤样品进行检测,在红菜薹(Brassica campestris L.ssp Chinensis L.var.utilis Tsen et Lee)种质和栽培管理相同条件下,分别测定对应土壤的红菜薹主薹和侧薹品质。结果表明,原产地种植的洪山菜薹主薹品质最好,公司甲黄土种植的洪山菜薹侧薹品质最好;在品种、田间管理相同的条件下,土质是关键所在;在江夏区搞好洪山菜薹示范生产,延伸产业链是可行的。

一种红菜薹新病害的病原鉴定及生物学特性研究

2010-2011年在湖北省红菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis L.var.utilis Tsen et Lee)栽培中发现一种新病害,并从该红菜薹新病害发病叶片分离得到了病原菌hctyk1,观察该病原菌的孢子形态,分析了病原菌的ITS序列,研究了病原菌的生物学特性。结果表明,该病原菌为链格孢[Alternaria alternata(Fr.:Fr.)Keissler],病原菌r DNA-ITS区序列已在Gen Bank上登录(登录号:JQ885954)。该菌菌丝生长致死温度为50℃;适宜pH为8;在供试的几种碳源、氮源中,最适的碳源是葡萄糖,最适的氮源是酵母浸出液。

红菜薹废弃物还田对四季豆产量和养分累积的影响

通过田间试验研究了红菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utili Tsen et Lee)废弃物还田以及化肥减施对四季豆产量和养分累积的影响。结果表明,在常规施肥的基础上,红菜薹废弃物半量和全量还田四季豆产量分别增加了13.41%和29.43%,与红菜薹废弃物全部还田相比,全部还田+化肥用量减施30%使得四季豆产量降低了25.41%;与单施化肥相比,全部还田+化肥用量减施30%处理四季豆生物量增加了9.38%。红菜薹还田氮素、磷素和钾素累积量分别较单施化肥处理增加了18.72%~32.55%、6.35%~38.22%和5.73%~41.87%,且富集的氮、钾主要存在茎、叶片和果实中。

高温对不同菜心品种生长及生理性状的影响

研究了高温对4个菜心品种生长及生理性状的影响。结果表明:501号和1号菜心品种在茎粗、叶数、叶面积、苔重、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性等指标上显著高于31号和2号品种,在丙二醛含量上显著低于31号和2号品种。试验结果说明501号和1号菜心品种的耐热特性强于31号和2号品种,是夏季高温季节种植的推荐品种。

新型红菜薹细胞质雄性不育系的花药发育细胞学观察

采用石蜡切片方法,对新型红菜薹细胞质雄性不育系及其保持系俞优的花药发育过程进行细胞学观察,以确定其花药败育的时期、方式和特点。研究结果表明:此红菜薹胞质不育系的花药败育发生于单核小孢子早期,表现为绒毡层细胞异常膨大,挤压单核早期小孢子,从而导致其败育。

酵素对红菜薹生长发育及土壤特性的影响

探讨了在施有7700kg·hm^(-2)生物有机肥的基础上,酵素对红菜薹(Brassica compestris L.ssp.chinensis L.var.utili Tsen et Lee)农艺性状、品质、养分利用效率以及对土壤养分动态和土壤酶活性的影响。结果表明:添加0.05%的酵素,可以有效改善红菜薹的品质,尤其可溶性糖含量较施用等量有机肥的处理增加了4.83%,硝酸盐含量降低了4.35%。酵素对提高土壤速效养分的含量和土壤酶的活性也有显著效果。

利用DAD1反义片段转化创建菜薹可调控雄性不育材料

菜薹因为没有好的雄性不育材料或自交不亲和系,至今尚无一代杂种用于生产,根据拟南芥及白菜型油菜的花药不开裂基因DAD1的保守序列设计引物,扩增菜薹的DAD1基因片段(DAD1F),构建反义DAD1F植物表达载体,用农杆菌介导法转化菜薹,对转基因植株进行分子检测,鉴定其雄性不育性并进行育性恢复试验。克隆得到的菜薹的DAD1基因片段大小为678bp,命名为BrcpDAD1F,其序列与拟南芥和白菜型油菜的DAD1高度同源,同源率分别为88%和99%;共得到了12株转基因植株,有6株在转录水平上得到表达,表现为雄性不育,花器官畸形,花粉活力低,萌发率不到10%,且开花后不能结角果或结空角果,或者得到极少种子但种子不萌发;用对照的花粉给转基因植株授粉可使其正常结实。以500μmol.L-1茉莉酸甲酯处理可使其雄性不育得到恢复,花粉可以在柱头和培养基上萌发,具有受精能力。T1代可育株与不育株的比例都呈1∶3分离,T2代不同株系的育性分离比例不同,有些株系继续呈1∶3的分离,有些株系全是可育株或全是不育株,说明反义抑制呈单基因稳定遗传。