利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条(Gp4和Gp5),测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18和iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%—55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN2及HN3处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移(HN2到HN3),该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。

Trxs过量表达对大麦成熟种子生理生化活性及蛋白组分的影响

为进一步了解硫氧还蛋白过量表达促进大麦种子萌发的机理,以硫氧还蛋白S基因(Trxs)过量表达的转基因大麦纯合株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照(CK)为试验材料,研究了Trxs过量表达对大麦成熟种子中硫氧还蛋白h(Trxh)催化活性、巯基含量、激素含量、蛋白组分及吸水速率的影响。结果显示:①转基因大麦成熟种子中Trxh催化活性显著高于CK(P<0.01);转基因大麦种子的还原状态增强,LSY-11-1-1种子中巯基含量显著高于CK(P<0.01);转基因大麦成熟种子的激素含量增加,其中LSY-11-1-1的赤霉素(GA)与生长素(IAA)含量显著高于CK(P<0.05)。②转基因大麦成熟种子中醇溶蛋白与CK明显不同,高分子量蛋白条带数与丰度高于CK。③转基因大麦的吸水速率比CK快,在萌发10、30和50 h时,LSY-11-1-1的含水量分别比CK增加了21.87%、15.38%和11.11%,差异显著(P<0.05)。上述结果表明,Trxs过量表达可以通过改变转基因大麦成熟种子中巯基含量、激素含量和醇溶蛋白组分等方式影响大麦种子萌发过程中的C、N转移效率,从而促进萌发进程。

大麦籽粒总蛋白含量及醇溶蛋白含量的差异性研究

为研究大麦籽粒总蛋白含量及醇溶蛋白的差异性。以来源不同的38份大麦品种为材料,采用FOSS凯氏定氮仪测定其籽粒总蛋白和醇溶蛋白含量,利用SDS-PAGE凝胶电泳技术分析参试材料醇溶蛋白带型。对参试材料的籽粒总蛋白含量、醇溶蛋白含量及醇溶蛋白带型的差异性和遗传多样性分析表明:38份大麦品种的总蛋白含量和醇溶蛋白含量的遗传差异显著,醇溶蛋白含量与总蛋白含量呈极显著正相关。根据醇溶蛋白含量将参试材料聚为3类;38个大麦品种SDS-PAGE凝胶电泳共分离出12条迁移率不同的条带,根据电泳谱带将共参试材料聚为构成18种类型,不同类型大麦品种数量差异较大。本研究为适宜蛋白质含量与醇溶蛋白含量大麦品种的选育提供了依据。