幽门螺杆菌HpaA重组蛋白的表达及免疫效果检测

目的表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性。方法用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Westernblot鉴定其反应原性。用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性。用重组蛋白免疫小鼠,分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量。结果重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%。表达产物相对分子质量为30000,目的蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上。Westernblot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16。小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组。结论已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗。

特异性结合幽门螺杆菌黏附蛋白A(HpaA)核酸适配子的筛选及鉴定

目的通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选特异性结合幽门螺杆菌(H.pylori)黏附蛋白A(HpaA)的核酸适配子,并鉴定其结合特性。方法构建pET28a/HpaA原核表达质粒并诱导表达纯化重组HpaA蛋白;以重组HpaA蛋白为靶标利用SELEX技术筛选出能够与HpaA具有高特异性、高亲和力结合的核酸适配子。随后利用筛选所得HpaA适配子通过体外实验验证与H.pylori菌体的结合以及对临床胃黏膜切片中H.pylori的检测效能。结果本研究培养并提取ATCC26695菌株基因组,通过PCR扩增HpaA部分基因长度约699 bp,并成功克隆构建了原核表达质粒pET28a/HpaA。经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达、纯化获得纯度约98%的重组HpaA蛋白作为筛选靶标。利用SELEX技术通过10轮正向筛选和5轮的负向筛选,获得6条与HpaA高亲和力的适配子分别命名为HA1~HA6。其中适配子HA6具有较高的亲和力和特异性,且适配子HA6核心序列在体外仍表现出与H.pylori菌体较高的结合力;利用羟基荧光素(FAM)标记的HA6适配子对166例H.pylori感染的患者胃黏膜中H.pylori进行检测,检出率为94.58%,高于同批次快速脲酶检测法的检出率(87.95%)。结论本研究筛选出的特异性结合H.pylori菌体表面HpaA的适配子,可能作为一种新的方法应用于胃黏膜组织中H.pylori的检测。

幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp) hpa A基因 ,构建 hpa A基因表达载体 ,鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 hpa A基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建p ET32 a的 hpa A表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果 :所克隆的 hpa A基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 .2 5 %～ 97.32 % ,氨基酸序列同源性高达 95 .38%～ 98.4 6%。p ET32 a- hpa A- BL2 1DE3系统的Hpa A融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hpa A融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp hpa A高效表达系统 ,所表达的 Hpa A融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Hp疫苗的抗原。

硫糖铝在体外对抗幽门螺杆菌HpaA IgY的保护作用评价

目的评价硫糖铝对HpaA IgY的保护作用,为制备IgY口服制剂奠定基础。方法大量诱导工程菌DH5α-HpaA-pQE30,制备纯化的重组蛋白HpaA。以HpaA为抗原接种洛曼母鸡,制备纯化的IgY。在不同pH值、含不同浓度胃蛋白酶的HpaA IgY液中加入不同浓度的硫糖铝;将IgY液反复冻融;以ELISA法测定HpaA IgY的剩余抗体活性(AR/AC)。结果在pH 1.5条件下,60%硫糖铝可使IgY抗体剩余活性维持65.8%;在pH 2.0条件下,含30%硫糖铝的IgY可使抗体活性维持85.4%,含50%硫糖铝的IgY可完全维持抗体活性。在pH 3.0条件下,含30%硫糖铝的IgY可使抗体活性维持87.3%,而含40%以上硫糖铝的IgY几乎可完全维持抗体活性。在胃蛋白酶浓度0.02mg/mL条件下,当含10%、30%、50%硫糖铝IgY的剩余活性,在pH值2.0时,分别为62.8%、71.6%、82.5%;在pH值3.0时,分别为75.6%、87.4%、94.5%;反复冻融后,含10%硫糖铝的IgY可使抗体活性提高到70.6%,含30%硫糖铝可使IgY的抗体活性提高到82.7%,50%硫糖铝可提高到89.3%。结论 30%以上的硫糖铝可增强VacA IgY对低pH和胃蛋白酶的耐受能力,抗冻融能力,是较理想的IgY保护剂。