不同浓度白藜芦醇对脑缺血-再灌注大鼠HSP20表达的影响

目的探讨不同浓度白藜芦醇对缺血-再灌注脑损伤大鼠神经功能损伤及热休克蛋白20（HSP20）表达的影响。方法将150只健康的成年雄性SD大鼠随机分成五组：假手术组，模型组（I／R组），小剂量白藜芦醇（2．5mS／kg）组，中剂量白藜芦醇（5mS／kg）组，大剂量白藜芦醇（10mS／kg）组，每组30只，制作脑缺血一再灌注大鼠模型，灌注前20min给予生理盐水或不同浓度白藜芦醇腹腔注射，术后6h、24h、48h、72h、7d时间节点分别评定神经功能缺损评分。应用四氮唑红染色（TFC）脑组织后计算脑梗死病灶体积并比较五组的差异；分别应用免疫组织化学染色和Western blot检测缺血脑组织周边区组织的HSP20表达量并比较五组的差异。结果①各组神经功能缺损评分比较：各模型组大鼠在缺血-再灌注后各时间节点均有神经功能缺损，同时白藜芦醇剂量越大，大鼠的神经功能缺损改善越明显；②各组脑梗死病灶体积比较：不同浓度白藜芦醇干预各组大鼠的脑梗死体积显著减少（P〈0．05），且白藜芦醇剂量越大，大鼠的脑梗死体积减少程度越大，呈显著剂量依赖性；③在各个时间点，各组大鼠缺血周边区脑组织的HSP20阳性细胞数为：大剂量白藜芦醇组〉中剂量白藜芦醇组〉小剂量白藜芦醇组〉模型组〉假手术组（P〈0．05），并且白藜芦醇剂量越大，大鼠的HSP20蛋白表达量越多。结论①缺血一再灌注脑损伤过程中，白藜芦醇能有效地保护大鼠脑神经细胞，减少脑梗死体积，改善神经功能缺损评分，这一作用可能是通过促进HSP20表达来完成的；②白藜芦醇对脑缺血一再灌注损伤的保护作用与剂量相关，并且呈现显著剂量依赖性。

拟南芥Hsp20基因家族的特征及其在干旱和盐胁迫下的表达分析

热激蛋白20(heat shock protein 20,Hsp20)是植物响应非生物胁迫时广泛合成的一类功能蛋白质,参与植物的抗逆过程。借助拟南芥基因组数据库,利用生物信息学方法分析Hsp20基因家族。HMMER搜索和蛋白质的理化性质分析表明,拟南芥至少含有30个Hsp20基因,其编码蛋白的分子质量为14.6~41.4 kD,且均含有α-晶状体蛋白结构域。系统发育分析表明,在30个拟南芥Hsp20成员中,22个归属于12个不同的亚家族,其余8个归于未知分类,可能为Hsp20类蛋白质(Hsp20-like)。共线性分析表明,片段复制与串联复制是Hsp20成员的主要扩增事件,大部分Hsp20不含或只含1个内含子。MEME分析结果表明,基序1、2、9是Hsp20共有的保守基序。转录组分析提示,15个Hsp20的表达水平在干旱和(或)盐胁迫后出现了上调,该结果得到了qRT-PCR实验的验证。以上结果为人们进一步探究Hsp20基因的生物学功能提供了理论依据。

大豆Hsp20基因家族生物信息学分析及高温高湿胁迫响应的分析

热激蛋白(Hsps)家族中的小热激蛋白(Hsp20)在保护植物免受非生物胁迫方面发挥至关重要的作用,为探究大豆Hsp20家族基因的特性及其对高温高湿胁迫的响应,对大豆进行了全基因组分析,本研究采用生物信息学方法对进化关系、保守结构域、染色体位置、启动子顺式调控元件和组织特异性表达情况进行预测分析,并采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对湘豆3号和宁镇1号两个大豆品种在高温高湿胁迫下不同时间的蛋白表达量进行了分析。结果表明:在大豆基因组中共查找出33个GmHsp20基因,不均匀分布在16条染色体上并根据系统发育分析和亚细胞定位结果分为11个亚族。序列分析表明GmHsp20蛋白表现出较高的结构保守性,含有典型的ACD结构域,32个GmHsp20基因(96.96%)没有内含子,或只有1个内含子。启动子分析表明,GmHsp20基因含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,其中MYB数目最多(110)个。基因组织特异性表达预测分析结果显示,除GmHSP22.6外,其余基因在各种组织和器官中均有表达。其中GmHSP18.5、GmHSP23.7、GmHSP15.2基因在所有组织中均高度表达。蛋白定量分析结果表明,与对照相比,宁镇1号和湘豆3号两个品种中,经高温高湿胁迫处理后,GmHSP18.5、GmHSP23.7、GmHSP26.0B、GmHSP17.8、GmHSP25.95个蛋白均上调表达,并且在两个品种间表达趋势基本一致,表明这些小热激蛋白家族成员可能参与了大豆对高温高湿胁迫的应答反应过程。本研究结果为进一步研究大豆小热激蛋白GmHsp20家族成员的功能提供有价值的信息。

家蝇热休克蛋白HSP20基因克隆、表达和序列分析

目的对家蝇热休克蛋白20(HSP20)基因进行生物信息学分析,并进行克隆、表达研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白序列的分析工具,结合其他生物信息学分析软件包,从Gen Bank上家蝇基因组序列识别出编码HSP20的基因,分析预测该蛋白质的结构功能;设计引物PCR扩增HSP20基因,将其克隆到原核表达质粒PEASY-E1中,重组质粒在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。结果 HSP20基因序列全长865bp,最大开放阅读框(ORF)为567bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21443.2 Da,等电点为5.96;所构建的重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定成功;SDS-PAGE分析结果显示,重组质粒在Origmi B/DE3中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为21443.2 Da,诱导12 h蛋白表达量最高,SDS-PAGE法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论成功构建PEASY-E1-HSP20重组原核表达质粒并表达出融合HSP20蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定基础。

胱抑素C对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质紧密连接的影响

目的:观察胱抑素C(Cys C)干预对脑缺血再灌注损伤(IRI)后大鼠脑皮质毛细血管内皮细胞紧密连接超微结构的形态学变化并探讨其影响机制。方法:雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血再灌注损伤组(IRI)和胱抑素C(Cys C)干预组(根据药物浓度不同分为低、中、高3个亚组分别为Cys C-L、Cys C-M和Cys C-H),采用改良线拴法建立大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注24 h模型。透射电镜下观察内皮细胞紧密连接超微结构的改变,Western Blot观察损伤侧脑皮质ZO-1蛋白表达变化,免疫荧光检测Hsp20的表达与分布。结果:与Sham组相比,IRI组电镜下可见毛细血管内皮细胞紧密连接开放,ZO-1蛋白表达明显减少(P <0. 01),Hsp20细胞数目增多。与IRI组比较,Cys C-L、Cys C-M组紧密连接开放程度明显减轻,ZO-1蛋白表达增加(P <0. 01),Hsp20阳性细胞数也显著增多。而Cys C-H组紧密连接结构消失,毛细血管内皮细胞间完全开放、松散;ZO-1蛋白表达明显降低,Hsp20阳性细胞数也明显减少。结论:Cys C在一定浓度下干预能减轻脑IRI对紧密连接超微结构的破坏,其机制可能与ZO-1蛋白表达增加及Hsp20阳性细胞个数增多有一定的关系。

热休克蛋白20与高尔基体在沙鼠前脑缺血再灌注后的变化及相关性

目的探讨在沙鼠脑缺血再灌注模型中,热休克蛋白20(HSP20)的表达变化及可能的神经保护作用和作用机制,检测高尔基体特异性标记物38(TGN38)的表达变化及HSP20与高尔基体的定位关系。方法通过夹闭双侧颈总动脉的方法建立沙鼠脑缺血再灌注模型;60只沙鼠随机分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组(I/R)。缺血再灌注组在缺血再灌注后6h、1d、3d、7d的各时间点分批处死动物,快速取脑组织,分别制作石蜡标本和提取蛋白,采用HE染色观察皮质区神经细胞变化;采用免疫组织化学方法检测皮质区HSP20阳性细胞数目;采用免疫荧光共聚焦的方法观察脑皮质细胞中HSP20与高尔基体的定位情况。采用免疫印迹技术,观察高尔基体及HSP20蛋白表达变化情况;全部数据用SPSS16.0进行统计分析。结果 HE染色:正常对照组和各假手术组的脑组织形态结构没有明显差异;I/R组根据时间点的不同可见胶质细胞增生、肥大,细胞间质和细胞水肿,神经元坏死。免疫组化染色HSP20的表达:正常对照组和各假手术组的脑组织中均有HSP20的表达,但表达较低。缺血再灌注损伤后HSP20的表达上调,于3d达到高峰,7d开始下降但仍高于正常组和假手术组(与正常组和各假手术组比较,P<0.05,不同时间点比较,P<0.05)。免疫荧光共聚焦:TGN38的免疫荧光及HSP20的免疫荧光在蒙古沙鼠皮质细胞内明显重叠。免疫印迹结果:我们通过免疫印迹的方法再次证实了在沙鼠前脑缺血再灌注后HSP20后的表达变化(变化趋势同免疫组化结果)。而TGN38在正常对照组、假手术组及缺血再灌注各组的表达无明显差异。结论 (1)HSP20在缺血再灌注的脑组织中表达升高并可能发挥神经保护作用。(2)在沙鼠皮质细胞内,HSP20存在于高尔基体,表明HSP20的靶向运输依赖高尔基体,同时HSP20可能对高尔基体具有重要保护作用。

miR-149-3p在先天性心脏病胎鼠心脏组织中的表达及其对P19细胞分化的影响

目的 探讨miR-149-3p在先天性心脏病(CHD)胎鼠心脏组织中的表达及其对小鼠畸胎瘤P19细胞分化的影响。方法 建立CHD室间隔缺损胎鼠模型,于妊娠第19天,HE染色观察心脏组织病理学变化,实时荧光定量PCR(qPCR)检测心脏组织中miR-149-3p和热休克蛋白蛋白家族B成员6(HSPB6)mRNA表达水平。二甲基亚砜(DMSO)诱导P19细胞向心肌细胞分化,并收集分化第0、5、10天的细胞,qPCR检测诱导分化过程中心肌分化标志物GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心房利钠尿多肽(ANP)的mRNA表达水平以及HSPB6 mRNA和miR-149-3p表达水平。miR-149-3p过表达慢病毒和空载慢病毒感染P19细胞,DMSO诱导分化第10天,免疫荧光染色检测细胞中cTnI蛋白表达情况,qPCR检测心肌分化相关标志物mRNA表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-149-3p与HSPB6之间的靶向关系。结果 与正常组比较,CHD组胎鼠出现心脏室间隔缺损,心脏组织中miR-149-3p高表达,而HSPB6低表达(P<0.01)。P19细胞在向心肌细胞分化的过程中,GATA4、cTnT、ANP和HSPB6mRNA水平均逐渐上升,而miR-149-3p表达水平逐渐下降(P<0.05)。诱导分化第10天,miR-149-3p过表达可明显降低心肌细胞分化率,并下调GATA4、cTnT、ANP mRNA表达水平(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-149-3p可以靶向调控HSPB6表达。结论 miR-149-3p可能通过靶向下调HSPB6抑制P19细胞向心肌细胞分化。

腺苷酸活化蛋白激酶活化cofilin诱导小动脉舒张的机制研究

背景与目的:腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对循环系统的调控作用已获得大量研究,并证实AMPK可以通过调控血管平滑肌细胞(VSMC)内游离Ca2+浓度来调节小动脉舒缩。前期研究发现,AMPK可通过增加cofilin活性导致细胞骨架链状肌动蛋白(F-actin)降解为单体肌动蛋白(G-actin)而扩张血管,本研究目的为进一步探讨AMPK活化cofilin的分子机制。方法:取C57BL6/N小鼠肠系膜上动脉的Ⅱ、Ⅲ级分支,在压力myograph模型上,检测离体动脉血管对肾上腺素和乙酰胆碱的反应,取收缩率>30%且舒张率>90%的血管用于实验;然后将血管分为两组,在预处理及高钾MOPS溶液预收缩后分别加入AMPK激活剂PT1 (PT1组)和溶剂DMSO (对照组),比较两组血管的扩张情况。然后采用Western blot法与免疫荧光Western blot法检测两组动脉组织中磷酸化AMPK (p-AMPK)及AMPK下游相关蛋白的表达。结果:所有实验动脉血管活性均符合要求,且两组血管之间的收缩与舒张能力差异无统计学意义(均P>0.05)。两组动脉血管直径在预处理及预收缩时差异均无统计学意义(均P>0.05)。在相应的处理后,PT1组血管逐渐扩张,而对照组无明显扩张,60 min后,PT1组血管扩张至(196.6±11.5)μm,而对照组直径为(136.1±8.1)μm,差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组比较,PT1组血管组织中p-AMPK、G-actin水平升高,分别为对照组的(3.25±0.52)倍、(2.26±0.64)倍,而磷酸化cofilin (p-cofilin)水平降低,为对照组的(0.48±0.19)倍,差异均有统计学意义(均P<0.05);总热休克蛋白20 (t-HSP20)无明显变化(P>0.05),但磷酸化HSP20 (p-HSP20)水平升高,为对照组的(2.45±0.52)倍,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:本研究结果提示,HSP20参与协助了AMPK对cofilin的活化,机制可能为活化的AMPK通过增加p-HSP20水平,竞争结合p-cofilin位点,促进其去磷酸化,增加cofilin活性,从而降低细胞骨架actin稳态,致血管舒张。

外源性硫化氢对脑缺血再灌注大鼠神经功能的作用及其机制探讨

目的探讨外源性硫化氢对脑缺血再灌注大鼠神经功能的作用及其机制。方法将240只雄性sD大鼠通过随机数字表法分为4组：假手术组，模型组，小剂量NaHS（3．2mg／kg）组，大剂量NaHS（6．4mg／kg）组，每组60只，线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，2h后再灌注，灌注前20min给予生理盐水或NaHS腹腔注射，术后不同时间点行神经功能缺损评分，四氮唑红染色观察脑梗死体积，免疫组化和Western印迹检测缺血周边区肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与热休克蛋白20（HSP20）表达。结果模型组各时间点均有明显的神经功能缺损症状，NaHS干预后神经功能缺损改善（P〈0．05），脑梗死体积减少（P〈0．05）；局灶性脑缺血再灌注后HSP20和TNF-α在再灌注6h～7d在缺血周边区神经元表达增加，与假手术组相比，HSP20表达量显著增加，灰度值分别为3．51±0．72、5．13±0．41、7．52±1．31、3．48±0．87（均P〈0．05），TNF-α表达量也显著增加，灰度值分别为0．74±0．13、1．13±0．19、0．87±0．26（均P〈0．05）、0．19±0．03（P〉0．05）。应用外源性硫化氢，脑缺血再灌注后各时间点HSP20表达均升高，大剂量组灰度值为4．41±0．61、7．56±0．35、10．3±1．03、3．92±1．09（均P〈0．05），TNF-α表达均降低，大剂量组灰度值为0．31±0．16、0．44±0．18、0．26±0．13、0．19±0．05（均P〈0．01）；干预组以大剂量NaHS组治疗效果更明显（P〈0．05）。结论NaHS可能通过诱导HSP20表达上调，抑制TNF-α表达，起到抗炎作用，减少脑梗死体积，从而起到神经保护作用。