日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究

以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象,通过cDNA末端快速扩增技术首次获得涡虫hsp60基因,cDNA全长1851 bp,编码575个氨基酸的蛋白质,命名为DjHSP60。生物信息学分析表明,DjHSP60含有HSP60家族的标签序列和末端重复序列GGM,亚细胞定位分析显示该蛋白定位于线粒体,属于线粒体HSP60家族。整体原位杂交和双荧光原位杂交显示,Djhsp60阳性细胞主要分布在实质组织中,具有干细胞的特征。涡虫切割后再生1 d,Djhsp60在伤口处的组织中表达显著增强,但随着再生进行,表达量逐渐降低。采用RNAi技术敲除Djhsp60导致涡虫头部逐渐退化,失去再生能力。原位杂交和qPCR研究结果证明,RNAi-Djhsp60下调干细胞相关基因的表达。上述结果揭示Djhsp60在涡虫再生中可能发挥重要作用,为进一步研究Djhsp60调控涡虫干细胞增殖的分子机制奠定了良好基础。

基于16S rRNA和HSP60基因序列分析粘细菌孢囊杆菌亚目形态分类的种属之间的亲缘关系

【目的】利用16SrRNA和HSP60基因分子标记分析鉴定形态分类特征不稳定的粘细菌种属。【方法】利用粘细菌的传统分离纯化方法从土壤中分离粘细菌,根据菌株的形态特征进行分类,PCR方法扩增菌株的16SrRNA和HSP60基因序列并进行系统发育关系分析。【结果】根据形态特征,分离得到的15株粘细菌菌株归入孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)的2个科3个属。其中11株粘细菌具有典型的所在种属的子实体结构,而菌株0085-4、0121-3、NM03和Myx9736的子实体结构发生了不同程度退化。15株粘细菌的16SrRNA基因序列的相似性在95.4%到99.5%之间。而HSP60基因序列差异较大。【结论】在属水平上,粘细菌形态分类特征和16SrRNA基因系统进化关系具有很好的一致性;在揭示粘细菌种间系统发育关系中,HSP60基因序列更为适用。

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。

三种致病耶尔森氏菌Hsp60基因序列的比较研究

目的 研究 3种致病耶尔森氏菌Hsp6 0基因序列的差异。方法 根据文献和基因库中的Hsp6 0基因序列设计了两对PCR引物 ,获得Hsp6 0基因的部分序列。将扩增产物纯化回收 ,克隆至 pGEM -T载体后进行测序。 结果 用CLUSTALX软件进行序列分析 ,发现 3种耶尔森氏致病菌的Hsp6 0基因序列较为保守 ,其中鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的该基因序列在所研究范围内仅相差一个碱基。结论 3种菌的Hsp6 0基因保守 ,不足以在此区间设计种特异性探针。小肠结肠炎耶尔森氏菌与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的Hsp6 0基因序列差异较大 。

基于HSP60基因哈氏弧菌PCR检测方法的建立

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。

两种粉虱Hsp60基因的克隆与表达

以近缘昆虫Hsp60基因保守区域设计兼并引物,PCR扩增烟粉虱(Bemisia tabaci)地中海(MED)隐种与温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)Hsp60基因cDNA,并检测了Hsp60基因受温度影响的表达情况。结果表明,烟粉虱MED隐种Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 821 bp,编码607个氨基酸;温室白粉虱Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 788 bp,编码596个氨基酸,Hsp60基因在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。温室白粉虱Hsp60基因表达量受温度影响显著(P<0.05),而烟粉虱MED隐种则不显著(P>0.05)。

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.

养殖刺参溃疡病病原菌RH2的鉴定及其生物学特性分析

从患溃疡病养殖刺参（Apostichopus japonicus）病灶处分离出3株优势菌（RH1、RH2、RH3）,以浸浴、体腔注射、体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株RH2为养殖刺参溃疡病的病原菌,其对刺参的LD50（半数致死量）每尾为5.68×10^6CFU,并证实浸浴、体腔注射的方式无法感染刺参,该菌可能通过体表创伤侵入的方式感染刺参。经形态学观察、生理生化特性分析、16SrRNA和HSP60基因测序确定菌株RH2为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）。基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示,菌株RH2与溶藻弧菌（AF513447）亲缘关系最近,置信度为50%;HSP60基因序列分析表明RH2与溶藻弧菌（AY332570、AF230931）聚为一个分支,且置信度高达99%。菌株RH2的最适生长盐度为25～35,最适生长pH为7.2～8.0,最适生长温度为14～22℃。对18种药物的敏感实验证实菌株RH2对诺氟沙星、复方新诺明、壮观霉素等较为敏感。

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98%,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98%以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92%。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水分离到1株优势细菌SR1,人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60(Heatshock protein,HSP)基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明,菌株SR1与溶藻弧菌(AY967727)亲缘关系最近,然而置信度较低,仅有27%,不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明,该菌株与溶藻弧菌(AF230931)同源性最高,为99.2%。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌(AF230931)聚为一个分支,且置信度较高,为84%。综合上述结果,菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学,2006,13(4):603-609]

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鉴定

为准确鉴定分离自我国四川鲜牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到种水平,作者运用16S rDNA序列分析、recA基因特异扩增和hsp60-RFLP等多种分子技术对分离自我国四川地区鲜牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌进行分类鉴定。结果证实,16S rDNA序列分析法可将9株乳酸菌初步归类为植物乳杆菌群(4株),肠膜明串珠菌(4株),瑞士乳杆菌(1株)。由于16S rDNA序列分析法不能区分植物乳杆菌和戊糖乳杆菌,为了进一步鉴定植物乳杆菌群中的4株菌,继续采用recA基因特异扩增和hsp60-RFLP技术对其细分,结果表明recA基因特异扩增和hsp60-RFLP的方法均能很好地把植物乳杆菌群中的4株菌鉴定到种水平,且均为植物乳杆菌。

海产品中溶藻弧菌的筛选及其致病因子的研究

溶藻弧菌能引起人类食物中毒。溶血毒素、耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)是致病性微生物中常见的致病因子。本文对从扇贝、牡蛎、贻贝、沙虾、虾蛄等海产品中筛选的溶藻弧菌的种属和致病因子进行了研究,生化鉴定显示分离到的两株溶藻弧菌来源不同,基因测定显示它们同属于溶藻弧菌(V.alginolyticus);血琼脂平板法、兔小肠结扎法和乳鼠灌胃法显示来源不同的溶藻弧菌其产毒种类也不同,两株溶藻弧菌都能产生不耐热性肠毒素(LT)和耐热性肠毒素(ST),但只有1株能产生溶血毒素。

诸氏鲻虾虎鱼致病性创伤弧菌的分离与鉴定

从患病的诸氏鲻虾虎鱼分离病原,研究其致病性。通过形态学观察、生理生化特性、HSP60序列扩增及系统发育树分析等方法系统鉴定,并进行了人工感染和毒力基因检测。结果表明,从患病的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织分离到1株革兰阴性杆菌,编号PYMc14-2,回归感染试验证实该菌株为诸氏鲻虾虎鱼的病原菌,毒力基因hemo检测结果阳性。生化特性结果与创伤弧菌类似,PCR扩增获得的486bp的HSP60基因序列与创伤弧菌(登录号AF230955.1)同源性达94%;系统进化树分析表明,PYMc14-2与创伤弧菌(登录号AF230955.1)聚为一簇,初步鉴定该菌为创伤弧菌。

大鼠Hsp60的组织表达、分子进化及真核表达载体构建

HSP60是热休克蛋白家族的一员具有重要的生物学功能。为了探讨大鼠Hsp60的组织表达、分子进化,并能构建其真核表达载体本研究通过qPCR技术研究其组织表达谱;从GenBank数据库获取其近缘序列通过多种方法和软件预测其分子特征、构建其系统发育树、并分析其适应性进化特点最后,构建真核表达载体pcDNA3.1-HSP60,并通过测序和Western blotting验证其准确性。结果显示:Hsp60在大鼠肾、脂肪、心、胃、肝、脑、肌肉、小肠及肺组织内的表达量依次下降,且在不同物种中的组织表达谱与其分子进化关系高度一致;大鼠Hsp60编码573氨基酸,不含信号肽和跨膜序列,以其序列矩阵构建的系统发育树与普遍接受的物种树高度一致;该基因在哺乳类动物中受强烈负选择作用(ω=0.03),且不同位点、不同类群所受选择压力不同,LRT结果极显著(p<0.01),其中在啮齿类动物中所受负选择压力最大(ω=0.02),同时发现位点380I受正选择作用(后验概率0.91)。此外测序及Western blotting结果表明真核表达质粒构建成功。综上,大鼠Hsp60是一个重要的管家基因具有较强的系统发育意义,且经历了一定的适应性进化过程,具有较大的研究价值所构建的表达载体可为后续该分子的功能和相关疾病研究提供基础。

从患病黑鲪分离病原菌HV0811的鉴定及其系统发育分析

从症状为渍疡瞎眼的养殖黑鲪（Sebastodes fuscescens）病灶处分离到3株优势菌HV0811、PT0811和JH0811，以肌肉注射人工感染实验证实菌株HV0811为致病菌，其对黑鳕的半致死浓度为7．15×10^5CFu／尾。通过对致病菌的形态学观察、生理生化分析表明：菌株HV0811为革兰氏阴性菌，极生单鞭毛，短杆状，直径1～3mm，需Na＋生长，低于4℃、高于42℃不生长。基于16SrRNA和HSP60基因序列构建的系统发育树表明：HV0811分别与哈维氏弧菌（AY750578和AY332571）相类聚，其中16SrRNA基因序列与哈维氏弧菌（AY750578）聚合置信度较低，仅有10％，不能有效地确定该种；HSP60基因序列与哈维氏弧菌（AY332571）聚合为一个分支的置信度达100％。综合该菌的形态、生理生化及HSP60基因序列比对结果，表明分离到的病原菌HV0811为哈维氏弧菌。药敏试验结果显示病原哈维氏弧菌（HV0811）对庆大霉素、新霉素、氟哌酸等较为敏感。

婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。

患溃烂症的眼斑拟石首鱼分离的灿烂弧菌的鉴定

【目的】从患溃烂症的眼斑拟石首鱼分离到优势菌株M-1,并进一步对该菌的系统发育学进行了分析。【方法】采用形态学、生理生化鉴定,结合16SrRNA和HSP60基因序列分析。【结果】16SrRNA基因同源性分析,菌株M-1与灿烂弧菌(AJ874361、AY046955)聚为一群;HSP60基因(groES)序列分析表明M-1与弧菌(EU653883、AY837440)聚为一个分支。【结论】菌株M-1属于灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。