Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 。

4-1BBL联合Hsp70-肿瘤抗原肽抑制小鼠黑色素瘤肺转移

背景与目的正调节性共刺激分子表达偏低是肿瘤逃避机体免疫系统攻击的重要原因之一,增加这些分子的表达是促进抗肿瘤免疫的研究热点。小鼠黑色素瘤B16-F1细胞株是弱免疫原性癌细胞株。本研究旨在观察4-1BBL联合Hsp70-抗原肽对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用,并探讨其机制。方法建立小鼠黑色素瘤肺转移模型,Hsp70-B16抗原肽小鼠皮下免疫,同时从尾静脉注射4-1BBL表达质粒p4-1BBL。于接种后第17天,解剖小鼠取肺组织,解剖显微镜下计数黑色素瘤肺转移结节的数目,并检测小鼠部分免疫学指标及肝、肾功能。结果4-1BBL联合Hsp70-B16抗原肽治疗组小鼠黑色素瘤肺转移结节数降至50±8,明显少于二者单独治疗组的500±80和450±40;联合治疗组小鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平分别增加了4倍和3倍,与对照组相比均存在显著性差异(P<0.01);单独应用4-1BBL基因或与Hsp70-B16抗原肽联合应用对小鼠肝、肾的功能均无明显影响。结论表达4-1BBL联合应用Hsp70-B16抗原肽主要通过增强外周T淋巴细胞功能活性而有效抑制小鼠黑色素瘤肺转移。

重组蛋白PSCA-HSP70的免疫活性及抗肿瘤效应观察

目的探讨重组前列腺干细胞抗原(PSCA)-热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白对前列腺肿瘤模型小鼠的免疫激活作用及抗肿瘤活性。方法健康雄性C57BL/6小鼠25只,随机均分为PSCA组、HSP组、PSCA+HSP组、PSCAHSP组及PBS组(n=5)。小鼠皮下注射1×106个前列腺肿瘤细胞(RM-PSCA/Luc细胞),3d后分别采用相应重组蛋白进行免疫(100μg/只),2周后采用相同剂量加强免疫1次,观察肿瘤生长及小鼠存活状况。加强免疫后10d处死动物,采用ELISPOT法和流式细胞术检测PSCA特异性T细胞反应,ELISA法检测PSCA特异性抗体水平。结果 ELISPOT法检测显示,PSCA-HSP组分泌IFN-γ的CD8+T细胞数明显高于其他各组(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,PSCA-HSP组CD8+/IFN-γ+T细胞数明显高于其他各组(P<0.05);ELISA检测显示,PSCA、PSCA+HSP、PSCA-HSP均可诱导产生PSCA特异的体液免疫反应,且3组间抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。PSCA-HSP组肿瘤体积明显小于其余各组,小鼠存活时间明显长于其余各组(P<0.05)。结论 HSP70是一种效应显著的分子伴侣,重组PSCA-HSP70融合蛋白在前列腺癌的治疗中具有重要的潜在应用价值。

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．

胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究

目的探讨胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞(DC)抗肿瘤作用。方法采用GM-CSF,IL-4刺激,培养胃癌患者外周血单个核细胞,增殖产生大量DC,用离子交换层析法从临床胃癌组织中提取Hsp70肽复合物,并行westernbolt鉴定,Hsp70-肽复合物修饰DC,通过细胞因子检测试剂盒对修饰DC上清液进行检测,用DC激活混合T淋巴细胞,观察其对胃癌细胞的杀伤作用。用未被Hsp70-肽复合物修饰DC作对照。结果Hsp70-肽复合物DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β含量分别为(305.02±20.70)pg/ml、(480.61±32.52)pg/ml和(519.60±39.12)pg/ml,而未被Hsp70修饰DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β的含量分别为(3.81±0.84)pg/ml、(3.50±0.21)pg/ml、(50.11±2.86)pg/ml,两者比较,有显著性差异(P<0.01)。Hsp70修饰DC激活的T淋巴细胞后对胃癌细胞的杀伤率为(93.54±8.26)%明显高于对照组的(6.20±0.38)%(P<0.01)。结论胃癌Hsp70-肽复合物致敏DC并激活T淋巴细胞后对胃癌细胞具有很强的杀伤作用。

榄香烯复合瘤苗HSP70-肿瘤肽活性成分的纯化及鉴定

[目的]探讨榄香烯复合瘤苗HSP70-肿瘤肽活性成分的纯化方法。[方法]以小鼠HCa-F肝癌和L615白血病细胞为肿瘤模型,分别制备两种榄香烯复合瘤苗,通过亲和层析法制备瘤苗的HSP70-肿瘤肽活性成分,免疫印迹法鉴定两种HSP70-肿瘤肽及其活性。[结果]两种HSP70-肿瘤肽样品均在70 kD附近呈现清晰的一条HSP70-肿瘤肽蛋白带;从HCa-F瘤苗中获得的HSP70-肿瘤肽产量为(2.34±0.28)mg/109个细胞,该产量约是等细胞数L615瘤苗产量的2倍。[结论]该方法适于HSP70-肿瘤肽活性成分的提取并能保持HSP70-肿瘤肽分子的免疫活性。

胶质瘤Hsp70-肽复合物激活T淋巴细胞抗肿瘤研究

目的研究胶质瘤Hsp70-肽复合物激活的T淋巴细胞抗肿瘤效应、探讨其用于临床治疗的可行性。方法取胶质瘤手术标本,经组织块法培养、建株胶质瘤细胞,冻融法获取胶质瘤细胞抗原,抗原与Hsp70体外构建Hsp70-肽复合物并激活T淋巴细胞,制备特异性CTL,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤作用。结果Hsp70-肽复合物激活CTL对胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于未经胶质瘤抗原激活的CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用(P<0.01)。结论肿瘤组织中或细胞中提取的Hsp70-肽复合物作用于T淋巴细胞,能诱导CTL在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异杀伤作用,为临床制备肿瘤疫苗奠定理论基础。

肝癌HSP70-肽复合物抗肿瘤研究

目的研究肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞的抗肿瘤作用,探讨其用于临床治疗的可行性。方法取肝癌手术标本,用凝胶梯度洗脱法从手术切取肝癌组织中提取HSP70-肽复合物,并激活T淋巴细胞,观察激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率。结果未经肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率明显低于HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率(P<0.01)。结论肝癌组织中或细胞中提取的HSP70-肽复合物作用于T淋巴细胞在体外对肝癌细胞能产生高效而特异的杀伤作用,在肿瘤免疫中起重要作用。

Hsp70-2及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的检测Heat shock protein 70-2(Hsp70-2)及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)组织中的表达,探讨两者在肿瘤发展中的作用及临床意义。方法收集人膀胱尿路上皮癌标本48例,膀胱尿路上皮癌旁组织标本20例,利用免疫组织化学S-P法、Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hsp70-2、14-3-3zeta在蛋白水平和mRNA水平的表达,分析两者与膀胱尿路上皮癌的病理分级、临床分期等因素间的关系。结果 3种检测方法均显示Hsp70-2、14-3-3zeta在癌旁组织中低表达,在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,其表达量随病理分级程度及浸润深度增高而增高,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Hsp70-2与14-3-3zeta蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达均增高,两者呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 Hsp70-2与14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,与病理分级,临床分期呈正相关,且两者之间也呈正相关,提示两者在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。

MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:疫苗诱导的抗肿瘤CD8+T细胞反应被认为在增加机体对肿瘤抵抗力方面起重要作用。研究发现,抗原递呈细胞摄取热休克蛋白70与肿瘤相关抗原的融合蛋白,并在MHCI类分子上处理提呈有此热休克蛋白为伴侣的肽后,会启动CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应。目的:构建黑色素瘤抗原3(MAGE-3)、人热休克蛋白70(HSP70)融合基因的真核表达载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。材料:pcDNA3.1(-)Vector为BD公司产品,pINCY/MAGE-3,pOTB7/HSP70为OpenBiosystems公司产品,DH5α由纳米生物技术重点实验室保存。方法:设计含XhoⅠ酶切位点MAGE-3引物及含KpnⅠ酶切位点人热休克蛋白70引物,以pINCY/MAGE-3和pOTB7/HSP70为模板扩增黑色素瘤抗原3和人热休克蛋白70基因片段,以基因片段为模板,采用MAGE-3上游引物(含XhoⅠ酶切位点)及人热休克蛋白70下游引物(含KpnⅠ酶切位点),PCR扩增MAGE-3-HSP70融合基因片段,KpnⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至pcDNA3.1(-),转化感受态大肠杆菌DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。主要观察指标:真核表达载体pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70的鉴定。结果:测序结果显示黑色素瘤抗原3与GeneBank上公布的序列完全一致,人热休克蛋白70有3处同义突变。结论:成功构建MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体。

热激蛋白HSP70在肿瘤免疫反应中作用的研究进展

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,在进化上高度保守。热激蛋白的功能有很多,充当分子伴侣,参与蛋白质折叠和转运。最近研究表明HSP70还在肿瘤免疫反应过程中起协同作用,充当呈递载体,将抗原肽呈递于APC表面引起CTL毒性杀死感染细胞和肿瘤细胞。在肿瘤的免疫治疗中作为免疫疫苗的载体有很好的前景。

热休克蛋白70-多肽复合物在肿瘤免疫领域的研究进展

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组广泛存在于细胞内的可溶性蛋白，在应激(如热休克、高温、感染、缺氧、氧化应激、异常代谢物积聚等)条件下高效表达。主要参与胞内新生肽的结合、折叠、装配、降解与跨膜转运，在维持细胞的正常结构和功能方面起着重要作用。根据其分子量的大小分为4个家族，即HSP90(83～90kD)家族、HSP70(66～78kD)家族、HSP60家族及小HSP家族。此外还有分子量为100～110kD而特性不同于上述家族的大分子HSP。

热休克蛋白Hsp70在抗原呈递过程中的作用

目的研究热休克蛋白Hsp70家族在抗原呈递中的作用,探讨其与肿瘤免疫反应的关系。方法利用反义RNA技术,将反义Hsp70、反义Hsc70、B7表达质粒导入肿瘤细胞B16中,24 h后检测细胞中热休克蛋白表达水平。利用混合淋巴细胞培养,检测T淋巴细胞增殖能力。结果在黑色素瘤细胞B16中转染pLXSN-antihsp70、pLXSN-antihsc70及2者共转染,转染反义质粒能够抑制B16细胞中Hsp70/Hsc70的表达,导致Hsp70表达下调,其刺激T淋巴细胞增殖能力均大幅下降。而将pLXSNmB7转染入B16细胞中,其刺激T细胞增殖的能力均有所上升。转染pLXSNmB7后,B16细胞中Hsp70/Hsc70的表达量有所提高。结论抑制各热休克蛋白Hsp70家族的表达能够导致T细胞增值数降低。在肿瘤细胞中导入B7分子能够提高Hsp70的表达水平,从而提高其抗原呈递的能力。

HSP70、visfatin、CA724联合检验在子宫内膜癌中的表达及临床诊断意义

目的:探讨热应激蛋白-70(HSP70)、内脂素(visfatin)、糖类抗原724(CA724)联合检验在子宫内膜癌中的表达及诊断意义。方法:选取2022年3月—2023年2月单县中心医院收治的子宫内膜癌患者45例作为观察组;另选取同期子宫良性病变患者45例作为对照组。对患者的HSP70、visfatin、CA724指标实施检查,对比两组患者的HSP70、visfatin、CA724指标水平差异和阳性检出率差异。采用受试者工作曲线(ROC)分析HSP70、visfatin、CA724及联合诊断在子宫内膜癌诊断中的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度。结果:观察组患者HSP70、CA724、visfatin水平显著高于对照组(P<0.05)。观察组患者的HSP70、CA724、visfatin阳性检出率高于对照组(P<0.05)。观察组中不同病理类型患者的HSP70、CA724、visfatin对比差异不显著(P>0.05)。观察组高分化患者的HSP70、CA724、visfatin高于低分化患者;中分化患者HSP70指标高于低分化患者;高分化患者HSP70、CA724、visfatin高于中分化患者(P<0.05)。ROC分析显示:HSP70、CA724、visfatin及联合诊断在子宫内膜癌中的AUC=0.715、0.736、0.615、0.871。结论:HSP70、CA724、visfatin在子宫内膜癌诊断中有重要参考价值,而其联合检测能够提升诊断的灵敏度,减少漏诊的发生。

热休克蛋白(HSP70)在肺癌中的表达及其临床意义

目的：测定热休克蛋白(heat shock protein HSP)在肺癌组织及正常肺组织中的表达，藉以探讨其在肺癌增殖、分化中的作用。方法：采用S-P免疫组化法，观察HSP70和PCNA在43例非小细胞肺癌（NSCLC）及5例小细胞肺癌(SCLC)中的表达情况。结果：NSCLC中HSP70表达较正常肺组织高；HSP70表达与PCNA表达有正相关关系；有淋巴结转移组HSP70表达高于无转移组；NSCLC中吸烟组HSP70表达高于不吸烟组。结论：HSP70在NSCLC组织中的高表达与癌细胞的增殖、转移有关，可能是调控肿瘤细胞增殖及凋亡的重要基因，可作为NSCLC的辅助诊断及判断预后的参考指标。

重组人Hsp70提呈的H22肝癌细胞混合抗原肽治疗小鼠肿瘤的研究

目的 探讨H2 2肝癌细胞混合抗原肽体内抑制小鼠肿瘤的最佳方式。方法 采用冻融、低渗振荡、加热沉淀及酸处理等方法从H2 2肝癌细胞中制备抗原肽 ;将接种过H2 2瘤细胞的小鼠分别给予Hsp70 H2 2肽复合物注射、复合物 +pCH5 10质粒注射或化疗后给予复合物 +质粒注射 ,观察肿瘤抑制情况。结果 上述方法制备的抗原肽为混合肽 ,其与Hsp70形成的复合物体内能够抑制小鼠肿瘤生长 ,并且这种复合物可与pCH5 10质粒协同完全抑制 10 5接种的瘤细胞形成肿瘤 ,但不能完全抑制 10 6接种的瘤细胞形成肿瘤 ,然而这种双因素与化疗进行衔接则可完全抑制 10 6接种的瘤细胞形成肿瘤。结论 H2 2肝癌细胞肿瘤混合抗原肽经rhHsp70提呈可诱导H2 2荷瘤小鼠产生特异性免疫保护作用 。

负载人热休克蛋白抗原肽的树突状细胞瘤苗在诱导抗胃癌免疫效应中的作用

目的评价负载人热休克蛋白70抗原肽的树突状细胞(HSP70PCs-DC)瘤苗在胃癌个体化治疗中引发的免疫应答。方法提取15例胃癌患者术后肿瘤组织的HSP70,其中5μg负载DC回输8例患者(5μg组)和50μg回输7例患者(50μg组),并分别在治疗前及第1次接种后的第6,9,13,17周采集抗凝外周血5mL,采用ELIS-POT技术检测抗原特异性T细胞数量,评价该瘤苗能否诱导抗胃癌的免疫应答。结果 11例(73.33%)患者在接受第一个疗程治疗后的第2周斑点数出现显著变化,9例在第9,13周时斑点数达到高峰,有效率81.82%(9/11),其后缓慢下降,但在第17周仍高于治疗前(P=0.001);从剂量上看,5μg组在各时间点平均每位患者的应答斑点数均高于50μg组,差别有统计学意义(P=0.008);未发生严重不良事件。结论 HSP70PCs-DC瘤苗具有较强的诱导患者抗肿瘤的细胞免疫应答功能,主要效应细胞是CD8+T细胞和Th1型细胞。该疫苗为抗肿瘤疫苗的进一步研究打下基础。