Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 。

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．

HSP_(70BCG)-Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用

用固相抗体法[1] 体外扩增人PBMC的γδT细胞 ,静息化处理后用HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物再次刺激研究HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用及TNF α生物学活性。3 H TdR掺入法测定细胞增殖。HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物活化的γδT细胞在效靶比为 10∶1及 5∶1时对靶细胞Daudi的杀伤活性分别为 88 36 %±8 2 1%及 75 2 3%± 16 36 % ,与对照组有显著性差别。 2 4及 4 8h增殖结果各组间无差别 ;未检测出各刺激组的上清中TNF α生物学活性有何差别。结论表明HSP70BCG

胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究

目的探讨胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞(DC)抗肿瘤作用。方法采用GM-CSF,IL-4刺激,培养胃癌患者外周血单个核细胞,增殖产生大量DC,用离子交换层析法从临床胃癌组织中提取Hsp70肽复合物,并行westernbolt鉴定,Hsp70-肽复合物修饰DC,通过细胞因子检测试剂盒对修饰DC上清液进行检测,用DC激活混合T淋巴细胞,观察其对胃癌细胞的杀伤作用。用未被Hsp70-肽复合物修饰DC作对照。结果Hsp70-肽复合物DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β含量分别为(305.02±20.70)pg/ml、(480.61±32.52)pg/ml和(519.60±39.12)pg/ml,而未被Hsp70修饰DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β的含量分别为(3.81±0.84)pg/ml、(3.50±0.21)pg/ml、(50.11±2.86)pg/ml,两者比较,有显著性差异(P<0.01)。Hsp70修饰DC激活的T淋巴细胞后对胃癌细胞的杀伤率为(93.54±8.26)%明显高于对照组的(6.20±0.38)%(P<0.01)。结论胃癌Hsp70-肽复合物致敏DC并激活T淋巴细胞后对胃癌细胞具有很强的杀伤作用。

HSP70-肝癌抗原肽复合物修饰DC瘤苗对CIK细胞增殖活性及表型变化的影响

目的研究热休克蛋白70(HSP70)-肝癌抗原肽(SMMC7721人肝癌细胞株)复合物修饰的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的增殖活性及表型的影响。方法获取健康供者的外周血单个核细胞(PBMC),培养2 h,贴壁细胞诱导分化DC,非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,DC生长第7日开始负载HSP70(A组)、肝癌抗原肽(B组)、HSP70-肝癌抗原肽复合物(C组),另设单纯DC组(D组),流式细胞检测CD80、CD86的表达,体外构建HSP70-抗原肽复合物-DC瘤苗,并将其和CIK细胞按1∶10的比例混合培养5 d,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖能力,以流式细胞仪检测DC及CIK细胞膜表面分子表达。结果 HSP70-肝癌抗原肽复合物可促进DC成熟,DC表面分子CD86、CD80在C组表达均较D组高(P均<0.01)。HSP70-肝癌抗原肽复合物-DC瘤苗可明显刺激CIK细胞的增殖。HSP70-肝癌抗原肽复合物-DC瘤苗与CIK共培养可使CIK细胞CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+的表达提高,与单纯培养CIK细胞比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 HSP70-肝癌抗原肽复合物能提高DC表面分子CD80、CD86等表达,诱导DC的成熟,HSP70-抗原肽复合物-DC瘤苗与CIK细胞共培养可明显增加CIK细胞的增殖活性,提高CIK细胞CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+的表达。

胶质瘤Hsp70-肽复合物激活T淋巴细胞抗肿瘤研究

目的研究胶质瘤Hsp70-肽复合物激活的T淋巴细胞抗肿瘤效应、探讨其用于临床治疗的可行性。方法取胶质瘤手术标本,经组织块法培养、建株胶质瘤细胞,冻融法获取胶质瘤细胞抗原,抗原与Hsp70体外构建Hsp70-肽复合物并激活T淋巴细胞,制备特异性CTL,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤作用。结果Hsp70-肽复合物激活CTL对胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于未经胶质瘤抗原激活的CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用(P<0.01)。结论肿瘤组织中或细胞中提取的Hsp70-肽复合物作用于T淋巴细胞,能诱导CTL在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异杀伤作用,为临床制备肿瘤疫苗奠定理论基础。

可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配体基因表达的影响。体内转染表达sPD 1,用MTT比色法检测HSP70 肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性。结果 :单独的sPD 1就有抗肿瘤效应。HSP70 肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL ,而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD 1及其配体的表达显著升高。用sPD 1与HSP70 肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠 ,能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70 肽疫苗的免疫效果。结论 :sPD 1可通过阻断PD 1与其配体的结合作用 ,及减弱PD 1的负反馈抑制作用 ,而增强HSP70

4-1BBL联合Hsp70-肿瘤抗原肽抑制小鼠黑色素瘤肺转移

背景与目的正调节性共刺激分子表达偏低是肿瘤逃避机体免疫系统攻击的重要原因之一,增加这些分子的表达是促进抗肿瘤免疫的研究热点。小鼠黑色素瘤B16-F1细胞株是弱免疫原性癌细胞株。本研究旨在观察4-1BBL联合Hsp70-抗原肽对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用,并探讨其机制。方法建立小鼠黑色素瘤肺转移模型,Hsp70-B16抗原肽小鼠皮下免疫,同时从尾静脉注射4-1BBL表达质粒p4-1BBL。于接种后第17天,解剖小鼠取肺组织,解剖显微镜下计数黑色素瘤肺转移结节的数目,并检测小鼠部分免疫学指标及肝、肾功能。结果4-1BBL联合Hsp70-B16抗原肽治疗组小鼠黑色素瘤肺转移结节数降至50±8,明显少于二者单独治疗组的500±80和450±40;联合治疗组小鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平分别增加了4倍和3倍,与对照组相比均存在显著性差异(P<0.01);单独应用4-1BBL基因或与Hsp70-B16抗原肽联合应用对小鼠肝、肾的功能均无明显影响。结论表达4-1BBL联合应用Hsp70-B16抗原肽主要通过增强外周T淋巴细胞功能活性而有效抑制小鼠黑色素瘤肺转移。

肺癌热休克蛋白70-多肽复合物的抗肿瘤免疫效应研究及其与热证的相关性

目的:观察不同证候患者肺癌组织热休克蛋白70-多肽复合物(HSP70-PC)对人类肺癌A-549细胞的抗肿瘤免疫效应,探讨其抗瘤效应是否存在证候相关性。方法:运用ADP亲和层析、DEAE离子交换层析、SDS-PAGE、Westem-blot、细胞培养、MTT检测等方法从人体肺癌组织及远端正常肺组织分离纯化HSP70-PC,观察不同证候患者肿瘤来源HSP70-PC对人外周血单个核细胞(PBMC)的激活增殖效应及致敏淋巴细胞对人肺癌A-549细胞的肿瘤细胞毒杀伤效应。结果:①热证癌PC组和非热证癌PC组促淋巴细胞增殖效应较空白对照组显著升高;所致敏淋巴细胞对人肺癌细胞均有很强的杀伤效应,与空白对照组相比,有显著性差异。②热证癌PC组较非热证癌PC组促淋巴细胞增殖效应及肿瘤细胞毒杀伤效应均有明显增高趋势。③肺癌患者远端正常肺组织HSP70-PC未见显著刺激淋巴细胞增殖作用,杀伤效应也未见明显升高。结论:人类肺癌组织HSP70-PC能够诱导针对人肺癌细胞的抗肿瘤免疫效应,其抗瘤效应很有可能与热证存在相关性。

肝癌HSP70-肽复合物抗肿瘤研究

目的研究肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞的抗肿瘤作用,探讨其用于临床治疗的可行性。方法取肝癌手术标本,用凝胶梯度洗脱法从手术切取肝癌组织中提取HSP70-肽复合物,并激活T淋巴细胞,观察激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率。结果未经肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率明显低于HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率(P<0.01)。结论肝癌组织中或细胞中提取的HSP70-肽复合物作用于T淋巴细胞在体外对肝癌细胞能产生高效而特异的杀伤作用,在肿瘤免疫中起重要作用。

小鼠肺腺癌热休克蛋白70-抗原肽复合物的纯化

目的 探索肿瘤热休克蛋白 70抗原肽复合物 (HCA70 )分离、纯化的方法。方法 采用低渗、反复冻融匀浆、ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析 ,从体外培养的小鼠肺腺癌细胞 (LA - 795)中纯化HAC70 ;通过SDS -PAGE电泳、Westernblot检测、小鼠移植瘤动物实验证实所获得蛋白是否为HAC70。结果 获得蛋白分子量为 70kD左右 ,与抗HSP70特异单抗结合 ,用此蛋白主动免疫的小鼠可抵抗LA795细胞的攻击 ,获得了高纯度的HAC70。结论 采用ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析可获得高纯度的HAC70。

感染非典型新城疫蛋鸡组织中HSP70抗原肽复合物提取与纯化

为建立从患有非典型新城疫的蛋鸡组织细胞中提取、纯化热休克蛋白HSP70抗原肽复合物的方法,采取三步蛋白纯化法从非典型新城疫蛋鸡肝脏组织中提取、纯化HSP70抗原肽复合物。经分级硫酸铵盐析后,依次用ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进行蛋白分子量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度。分离、纯化得到的蛋白经SDS-PAGE、银染鉴定为单一带,分子量为70ku;Western blotting结果证实为HSP70。每克新鲜肝脏细胞最终获得90～110μgHSP70。使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70抗原肽复合物。

榄香烯复合瘤苗HSP70-肿瘤肽活性成分的纯化及鉴定

[目的]探讨榄香烯复合瘤苗HSP70-肿瘤肽活性成分的纯化方法。[方法]以小鼠HCa-F肝癌和L615白血病细胞为肿瘤模型,分别制备两种榄香烯复合瘤苗,通过亲和层析法制备瘤苗的HSP70-肿瘤肽活性成分,免疫印迹法鉴定两种HSP70-肿瘤肽及其活性。[结果]两种HSP70-肿瘤肽样品均在70 kD附近呈现清晰的一条HSP70-肿瘤肽蛋白带;从HCa-F瘤苗中获得的HSP70-肿瘤肽产量为(2.34±0.28)mg/109个细胞,该产量约是等细胞数L615瘤苗产量的2倍。[结论]该方法适于HSP70-肿瘤肽活性成分的提取并能保持HSP70-肿瘤肽分子的免疫活性。

HSP70-骨肉瘤肽复合物激活树突状细胞诱导抗骨肉瘤免疫的研究

目的使用热休克蛋白70(HSP70)和骨肉瘤肽修饰树突状细胞(dentriticcell,DC),研究其作用规律,探讨通过DC提呈途径降低肿瘤抗原肽用量诱导抗骨肉瘤免疫的可行性。方法于体外使HSP70和骨肉瘤抗原肽结合,修饰DC,检测DC的代谢活性及分泌的细胞因子;检测注射DC和HSP70-骨肉瘤肽对小鼠肿瘤的抑制作用。结果HSP70结合骨肉瘤肽可使DC成熟;以HSP70结合骨肉瘤肽修饰后成熟的DC注射免疫,注射量达到8×104DC时,即可产生明显的抑瘤效应,其抑瘤作用呈数量依赖关系。结论DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径能够有效杀伤肿瘤。

HSP70-PC肽复合物与树突状细胞成熟关系的实验研究

目的探讨HSP70-PC肽复合物与人外周血来源的树突状细胞DC成熟之间的关系。方法采用GM—CSF、IL-4刺激培养人外周血单个核细胞，增殖产生大量DCS；从肺癌细胞中获取肽复合物，通过细胞因子检测试剂盒进行检测。结果发现HSP70-PC肽复合物修饰的DDC大量分泌IL-12、TNF-α等细胞因子。结论HSP70-PC肽复合物可诱导DC成熟，体外产生特异性反应。

热休克蛋白70-多肽复合物在肿瘤免疫领域的研究进展

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组广泛存在于细胞内的可溶性蛋白，在应激(如热休克、高温、感染、缺氧、氧化应激、异常代谢物积聚等)条件下高效表达。主要参与胞内新生肽的结合、折叠、装配、降解与跨膜转运，在维持细胞的正常结构和功能方面起着重要作用。根据其分子量的大小分为4个家族，即HSP90(83～90kD)家族、HSP70(66～78kD)家族、HSP60家族及小HSP家族。此外还有分子量为100～110kD而特性不同于上述家族的大分子HSP。

热休克蛋白-抗原肽复合物疫苗预防肝癌术后复发32例

目的:探讨热休克蛋白-抗原肽复合物(HSP)疫苗预防肝癌术后复发的效果.方法:回顾性分析32例应用HSP疫苗的原发性肝癌患者,并检测治疗前后T细胞亚群、NK细胞活性和血清IL-2受体水平的变化,计算3 a内的生存率,并与对照组比较.结果:治疗组术后3 mo CD3+,CD8+,CD4+/CD8+水平与术前和对照组比较有显著性差异(P<0.05),NK细胞活性较治疗前明显升高(P<0.01);治疗组3a生存率为68.8%,与对照组37.5%比较明显升高(P<0.05).结论:肝癌术后应用HSP疫苗能明显提高患者免疫功能,且可预防术后复发、提高远期生存率.

人消化道癌组织HSP70的检测及其多肽复合物的分离研究

目的分析人消化道癌组织蛋白表达谱的差异并分离纯化食管癌组织中HSP70-多肽复合物。方法提取人食管、胃及大肠的癌组织、癌旁组织和正常组织的蛋白质,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行电泳分析;同时以食管癌组织为材料,通过层析柱分离纯化HSP70-多肽复合物。结果相同器官的不同组织中不同分子量蛋白的种类基本一致,但丰度则表现出差异;同时分离到食管癌细胞的HSP70-多肽复合物。结论不同分子量的蛋白质在不同组织中表达的丰度不同,可能与组织细胞生命活动状态相关。HSP70-多肽复合物的分离为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了具体方法,为深入研究和利用HSP70蛋白奠定了基础。

热休克蛋白-肽复合物与肿瘤免疫

热休克蛋白（heat shock protein,HSP）是一类在生物进化过程中高度保守,广泛表达于所有生命机体组织细胞并具有管家功能的蛋白质。根据分子量的差异,HSP可分为10个家族,包括HSP110/grp170、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27等,每个家族有1~5个成员[1]。在正常生理状态下,