Hsp70-H22肿瘤细胞肽复合物与树突状细胞成熟的关系

探讨热休克蛋白 70 (Hsp70 ) - H2 2肽复合物与小鼠骨髓来源的树突状细胞 (dendritic cell,DC)成熟之间的关系。采用 GM- CSF、IL- 4刺激培养小鼠骨髓细胞 ,增殖产生大量 DCs;从 H2 2肝癌细胞中获取肿瘤细胞肽 ,体外与Hsp70进行结合 ,结合产物修饰 DC,通过细胞因子检测试剂盒和流式细胞仪对修饰的 DCs上清液和 DCs膜表面分子进行检测。发现 Hsp70 - H2 2肽复合物修饰的 DCs大量分泌 IL- 12、TNF- α、IL- 1β等细胞因子 ,并且高表达主要组织相容性 类抗原 (MHC 类 )、 CD80、 CD40等分子 ,而单独的 Hsp70或 H2 2肽则不具有此作用。结果提示 :Hsp70 - H2 2肽复合物可诱导 DC成熟 ,这种成熟的

B7-1B7-H1相对比例变化对Hsp70-肽复合物抗肿瘤免疫效应的影响

目的 :探讨Hsp70-肽复合物对B7-1 B7-H1相对比例的影响及真核表达可溶性PD-1(sPD-1)对Hsp70-肽复合物抗肿瘤作用的影响。方法 :通过RT-PCR和半定量PCR技术检测Hsp70 肽复合物体外刺激和体内免疫对小鼠脾细胞正调控共刺激分子B7-1和抑制性共刺激分子B7-H1及其受体PD-1表达的影响 ;体内转染表达sPD-1后 ,观察Hsp70-肽复合物免疫小鼠的肿瘤生长以及脾淋巴细胞毒性的变化。结果 :基因表达检测表明 ,Hsp70- 肽复合物体外刺激的小鼠脾细胞B7-1mRNA和B7-H1mRNA的水平随时间而变化 ,B7-1/B7-H1比值随刺激时间而增高 ;Hsp70-肽复合物体内免疫小鼠后期脾细胞B7-1表达下降 ,B7-H1及其受体PD-1表达上调 ,B7-1/B7 H1比值逆转 ;体内表达sPD-1可显著增强和延长Hsp70 肽复合物的抑瘤效果 ;体内表达sPD-1可提高Hsp70-肽复合物免疫的荷瘤小鼠脾细胞的杀伤率。结论 :Hsp70-肽复合物的刺激引起共刺激分子B7-1和B7-H1表达的变化 ,B7-1/B7-H1的比例与激活效应相关 ,sPD-1通过阻抑B7-H1/PD-1途径、上调B7-1/B7-H1比例 ,可增强免疫应答 ,提高Hsp70

可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配体基因表达的影响。体内转染表达sPD 1,用MTT比色法检测HSP70 肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性。结果 :单独的sPD 1就有抗肿瘤效应。HSP70 肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL ,而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD 1及其配体的表达显著升高。用sPD 1与HSP70 肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠 ,能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70 肽疫苗的免疫效果。结论 :sPD 1可通过阻断PD 1与其配体的结合作用 ,及减弱PD 1的负反馈抑制作用 ,而增强HSP70

Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 。

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．

二磷酸腺苷琼脂糖亲和层析法纯化HSP70多肽复合物

采用二磷酸腺苷 (ADP)琼脂糖亲和层析的方法 ,从小鼠肝脏或肿瘤组织中纯化热休克蛋白 (HSP) 70多肽复合物。用 Western blot和硝酸银染色对所纯化的蛋白质进行鉴定 ,表明纯化的蛋白质为均一的 HSP70。为了证实纯化的 HSP70是否为 HSP70多肽复合物 ,将此纯化物与 10 mmol/ L ATP,3mm ol/ L Mg Cl2 ,0 .5 mmol/ L Ca Cl2 孵育后 ,用centricon 10滤过并收集小分子片段 ,经反向高压液相色谱分析 ,发现在 2 15 nm和 2 2 0 nm有很多吸收峰 ,证明此 HSP70为 HSP70多肽复合物。一般情况下 ,采用 ADP琼脂糖亲和层析方法 1g组织可以获得 12 0μg

人消化道癌组织HSP70的检测及其多肽复合物的分离研究

目的分析人消化道癌组织蛋白表达谱的差异并分离纯化食管癌组织中HSP70-多肽复合物。方法提取人食管、胃及大肠的癌组织、癌旁组织和正常组织的蛋白质,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行电泳分析;同时以食管癌组织为材料,通过层析柱分离纯化HSP70-多肽复合物。结果相同器官的不同组织中不同分子量蛋白的种类基本一致,但丰度则表现出差异;同时分离到食管癌细胞的HSP70-多肽复合物。结论不同分子量的蛋白质在不同组织中表达的丰度不同,可能与组织细胞生命活动状态相关。HSP70-多肽复合物的分离为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了具体方法,为深入研究和利用HSP70蛋白奠定了基础。

HSP_(70BCG)-Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用

用固相抗体法[1] 体外扩增人PBMC的γδT细胞 ,静息化处理后用HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物再次刺激研究HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用及TNF α生物学活性。3 H TdR掺入法测定细胞增殖。HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物活化的γδT细胞在效靶比为 10∶1及 5∶1时对靶细胞Daudi的杀伤活性分别为 88 36 %±8 2 1%及 75 2 3%± 16 36 % ,与对照组有显著性差别。 2 4及 4 8h增殖结果各组间无差别 ;未检测出各刺激组的上清中TNF α生物学活性有何差别。结论表明HSP70BCG

肺腺癌组织中HSP70多肽复合物的分离及纯化

目的:探讨肺腺癌组织中HSP70多肽复合物分离及纯化的可行性方案。方法:采用裂解液裂解、超声破碎、ConA-sepharose亲和层析和DEAE阴离子交换层析方法,从肺腺癌组织中分离纯化HSP70蛋白复合物;通过SDS-PAGE电泳、Westernblot检测获得蛋白;运用Bradford法对其进行定量分析。结果:通过该实验方法可以从1g肺癌组织中获取110μg左右的HSP70多肽复合物,其相对分子质量为70000。结论:采用ConA-sepharose亲和层析和DEAE阴离子亲和层析相结合的蛋白纯化法可以获取高纯度的HSP70多肽复合物。

sCD40L联合TB.HSP70-H22肽刺激树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的探讨受sCD40L与结核杆菌HSP70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,TB.HSP70)-H22肽联合刺激的树突状细胞(dendritic cell,DC)在体内外的特异性抗肿瘤免疫。方法取小鼠骨髓于培养第7天分为未刺激组、sCD40L组、TB.HSP70-H22肽组、sCD40L+TB.HSP70-H22肽组,共4组,分别给予相应干预,24 h后取上清,ELISA法检测IL-12、IL-10,流式细胞术检测CD40、CD80,混合淋巴细胞反应(MRL)检测淋巴细胞增殖,MTT法检测对肿瘤细胞的杀伤率;建立小鼠肝癌模型,完全随机分为5组(分别给予生理盐水和以上4种干预获得的DC干预),Ⅰ组:生理盐水对照组,Ⅱ组:未刺激DC治疗组,Ⅲ组:sCD40L DC治疗组,Ⅳ组:TB.HSP70-H22肽DC治疗组,Ⅴ组:sCD40L+TB.HSP70-H22肽DC治疗组,于第21天测瘤质量,ELISA法测血清IL-10、IFN-γ。结果sCD40L+TB.HSP70-H22肽组的各项指标与其他各组相比,IL-10显著降低,其他指标均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅴ组与其他各组相比,IL-10和瘤质量均显著降低,IFN-γ显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论受sCD40L与TB.HSP70-H22肽复合物联合刺激后的DC被充分激活,能诱导强有力的特异性抗肿瘤细胞免疫,对H22瘤细胞产生强大的杀伤作用,显著抑制肿瘤的生长。

感染非典型新城疫蛋鸡组织中HSP70抗原肽复合物提取与纯化

为建立从患有非典型新城疫的蛋鸡组织细胞中提取、纯化热休克蛋白HSP70抗原肽复合物的方法,采取三步蛋白纯化法从非典型新城疫蛋鸡肝脏组织中提取、纯化HSP70抗原肽复合物。经分级硫酸铵盐析后,依次用ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进行蛋白分子量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度。分离、纯化得到的蛋白经SDS-PAGE、银染鉴定为单一带,分子量为70ku;Western blotting结果证实为HSP70。每克新鲜肝脏细胞最终获得90～110μgHSP70。使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70抗原肽复合物。

胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究

目的探讨胃癌Hsp70-肽复合物致敏树突状细胞(DC)抗肿瘤作用。方法采用GM-CSF,IL-4刺激,培养胃癌患者外周血单个核细胞,增殖产生大量DC,用离子交换层析法从临床胃癌组织中提取Hsp70肽复合物,并行westernbolt鉴定,Hsp70-肽复合物修饰DC,通过细胞因子检测试剂盒对修饰DC上清液进行检测,用DC激活混合T淋巴细胞,观察其对胃癌细胞的杀伤作用。用未被Hsp70-肽复合物修饰DC作对照。结果Hsp70-肽复合物DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β含量分别为(305.02±20.70)pg/ml、(480.61±32.52)pg/ml和(519.60±39.12)pg/ml,而未被Hsp70修饰DC分泌IL-12、TNF-α、IL-1β的含量分别为(3.81±0.84)pg/ml、(3.50±0.21)pg/ml、(50.11±2.86)pg/ml,两者比较,有显著性差异(P<0.01)。Hsp70修饰DC激活的T淋巴细胞后对胃癌细胞的杀伤率为(93.54±8.26)%明显高于对照组的(6.20±0.38)%(P<0.01)。结论胃癌Hsp70-肽复合物致敏DC并激活T淋巴细胞后对胃癌细胞具有很强的杀伤作用。

食管癌组织中HSP70的基因表达及其多肽复合物的分离

目的研究食管癌组织中HSP70的表达情况,探索HSP70-多肽复合物分离的可行性途径。方法采用人HSP70基因探针P17与人食管癌组织中提取的RNA进行Northern杂交;用亲和柱层析法分离HSP70-多肽复合物。结果癌组织提取物出现了比正常组织较强的杂交信号,从食管癌组织中提取蛋白质,经一系列层析柱(Con-Asepharose、ADP-agarose、MonoQ及HSP70抗体亲和层析柱),分离到HSP70-多肽复合物。结论HSP70基因在食管癌组织中的高表达,为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了可行性方法。

胶质瘤Hsp70-肽复合物激活T淋巴细胞抗肿瘤研究

目的研究胶质瘤Hsp70-肽复合物激活的T淋巴细胞抗肿瘤效应、探讨其用于临床治疗的可行性。方法取胶质瘤手术标本,经组织块法培养、建株胶质瘤细胞,冻融法获取胶质瘤细胞抗原,抗原与Hsp70体外构建Hsp70-肽复合物并激活T淋巴细胞,制备特异性CTL,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤作用。结果Hsp70-肽复合物激活CTL对胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于未经胶质瘤抗原激活的CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用(P<0.01)。结论肿瘤组织中或细胞中提取的Hsp70-肽复合物作用于T淋巴细胞,能诱导CTL在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异杀伤作用,为临床制备肿瘤疫苗奠定理论基础。

HSP70-骨肉瘤肽复合物激活树突状细胞诱导抗骨肉瘤免疫的研究

目的使用热休克蛋白70(HSP70)和骨肉瘤肽修饰树突状细胞(dentriticcell,DC),研究其作用规律,探讨通过DC提呈途径降低肿瘤抗原肽用量诱导抗骨肉瘤免疫的可行性。方法于体外使HSP70和骨肉瘤抗原肽结合,修饰DC,检测DC的代谢活性及分泌的细胞因子;检测注射DC和HSP70-骨肉瘤肽对小鼠肿瘤的抑制作用。结果HSP70结合骨肉瘤肽可使DC成熟;以HSP70结合骨肉瘤肽修饰后成熟的DC注射免疫,注射量达到8×104DC时,即可产生明显的抑瘤效应,其抑瘤作用呈数量依赖关系。结论DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径能够有效杀伤肿瘤。

HSP70-PC肽复合物与树突状细胞成熟关系的实验研究

目的探讨HSP70-PC肽复合物与人外周血来源的树突状细胞DC成熟之间的关系。方法采用GM—CSF、IL-4刺激培养人外周血单个核细胞，增殖产生大量DCS；从肺癌细胞中获取肽复合物，通过细胞因子检测试剂盒进行检测。结果发现HSP70-PC肽复合物修饰的DDC大量分泌IL-12、TNF-α等细胞因子。结论HSP70-PC肽复合物可诱导DC成熟，体外产生特异性反应。

肝癌HSP70-肽复合物抗肿瘤研究

目的研究肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞的抗肿瘤作用,探讨其用于临床治疗的可行性。方法取肝癌手术标本,用凝胶梯度洗脱法从手术切取肝癌组织中提取HSP70-肽复合物,并激活T淋巴细胞,观察激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率。结果未经肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率明显低于HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率(P<0.01)。结论肝癌组织中或细胞中提取的HSP70-肽复合物作用于T淋巴细胞在体外对肝癌细胞能产生高效而特异的杀伤作用,在肿瘤免疫中起重要作用。

热休克蛋白70-H22肽刺激DC诱导特异性抗肝癌免疫

目的探讨热休克蛋白70(TB.HSP70)-H22肽是否能促进树突状细胞(DC)活化成熟并诱导H22特异性抗肿瘤免疫。方法取小鼠骨髓于培养第7天分为A、B、C 3组,分别给予未刺激、TB.HSP70-H22肽(10μg/mL)、TB.HSP70-H22肽(20μg/mL)干预24h,取上清液用ELISA法检测IL-12、IL-10,用FACS法检测CD40、CD80,用混合淋巴细胞反应检测淋巴细胞增殖,用MTT法检测DC活化淋巴细胞对H22和B16肿瘤细胞杀伤率。结果与A组比较,B、C组除对B16细胞杀伤率差异无统计学意义外,B、C组IL-10明显降低,CD40、CD80、IL-12、淋巴细胞增殖程度和对H22杀伤率均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组对B16细胞杀伤率差异无统计学意义,IL-10明显降低,CD40、CD80、IL-12、淋巴细胞增殖程度和对H22杀伤率均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TB.HSP70-H22肽能明显促进DC活化成熟,诱导H22特异性抗肿瘤免疫,为该疫苗用于肝癌免疫治疗提供了理论基础。

热休克蛋白70-多肽复合物在肿瘤免疫领域的研究进展

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组广泛存在于细胞内的可溶性蛋白，在应激(如热休克、高温、感染、缺氧、氧化应激、异常代谢物积聚等)条件下高效表达。主要参与胞内新生肽的结合、折叠、装配、降解与跨膜转运，在维持细胞的正常结构和功能方面起着重要作用。根据其分子量的大小分为4个家族，即HSP90(83～90kD)家族、HSP70(66～78kD)家族、HSP60家族及小HSP家族。此外还有分子量为100～110kD而特性不同于上述家族的大分子HSP。

Hsp70-H22肿瘤抗原肽复合物激活树突状细胞诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 探讨通过树突状细胞 (DC)提呈途径降低肿瘤抗原肽用量的可行性 ,了解热休克蛋白 70 (Hsp70 )和抗原肽修饰DC作用的特点。方法 以Hsp70于体外结合抗原肽 ,并于体外修饰DC ,检测修饰后DC的代谢活性及分泌的细胞因子 ;比较修饰后DC和Hsp70 H2 2肽对淋巴细胞的激活作用 ;检测激活的淋巴细胞对H2 2瘤细胞的细胞毒作用以及注射DC和Hsp70 H2 2肽对小鼠肿瘤的抑制作用。结果 Hsp70结合 0 .15 μgH2 2肽可使 2× 10 5DC成熟 ,4× 10 3 成熟DC可激活 2× 10 6淋巴细胞 ;Hsp70结合 0 .0 0 3μg肽修饰的DC或Hsp70结合 0 .15 μg肽直接刺激 ,可激活相同数量的淋巴细胞 ,产生同样的杀瘤效果。激活DC后再回输的治疗方式与直接注射Hsp70 肽复合物的治疗方式相比 ,抗原肽的用量可以降低 5 0倍。正常肝组织来源的混合肽结合Hsp70后 ,不能使DC成熟 ,亦不能通过DC途径活化脾淋巴细胞。结论 DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径能够有效降低Hsp70 肿瘤抗原肽复合物使用剂量。正常细胞的混合肽不能通过Hsp70和DC提呈激活淋巴细胞 。