大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列,该序列全长2982 bp,含1个长度为2052 bp的开放阅读框,编码683个氨基酸组成的多肽,多肽等电点约为6.30,分子质量约为77.8 kDa;推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%,属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75,已提交至GenBank(登录号为MN068810)。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现,经LC50吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC30浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高;经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程,为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。

HSP75小干扰RNA对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和迁移的影响

探讨沉默HSP75基因对人骨肉瘤细胞系U2-OS增殖和迁移的影响。设计针对HSP75的特异性小干扰RNA(siRNA),利用RNAiMAX转入U2-OS,并用Western blot方法检测转染效果。实验分空白对照组、阴性对照组和转染组,CCK8法检测细胞的增殖情况,TransweIl迁移实验检测细胞迁移力,Western blot方法检测人基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达水平。与空白对照组和阴性对照组比较,转染组中HSP75蛋白表达明显降低,抑制率为(84.13±3.2)%(P<0.05),细胞的增殖能力被明显抑制(P<0.05),细胞的迁移能力明显下降(P<0.05),MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。沉默HSP75能有效抑制人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞的增殖和迁移,可能是骨肉瘤治疗的分子靶点。

人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor nec-rosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA。选择NdeⅠ和XhoⅠ分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上。重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序。测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1。通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高。结果表明,在39℃条件下,OD600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白的表达量最高。该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。