Hsv-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有Hsvtk、重组人IL2rhIL2、TNFαrhTNFα不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法:经分离人外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcellPBMC总RNA,以反转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCR制备人IL2互补DNAcomplementaryDNAcDNA模板。分别以PCR方法扩增3种基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆经鉴定后测序。将测序正确的各目的基因分别从测序载体相应酶切位点消化后,回收并纯化后与经相同双酶消化后的线性化PLXSN表达载体连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑取阳性菌落后,提取质粒酶切鉴定插入片段大小和位置以获得正确重组子。按上述定向克隆方法依次将各片段正向插入至PLXSN表达载体的多克隆位点间,以构建含不同融合基因的真核表达载体。结果:经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论:Hsvtk、IL2、TNFα不同组合融合基因表达载体的成功构建为喉癌的基因治疗提供部分实验基础也为表达具有多功能活性的新型融合蛋白和发现细胞因子的新功能提供有利条件。