小续命汤对OGD/R诱导HT22细胞损伤后突触可塑性的影响

目的:探讨小续命汤(XXMD)对缺血性脑卒中后脑缺血再灌注损伤突触可塑性的影响。方法:体外建立小鼠海马神经元(HT22细胞)氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,模拟脑缺血性脑卒中后海马神经元缺血再灌注损伤。采用CCK-8法检测HT22细胞活力,筛选XXMD最佳作用浓度。将HT22细胞随机分为对照组、OGD/R组和OGD/R+XXMD组,倒置荧光显微镜观察各组细胞形态变化,ELISA法测定细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,透射电镜观察细胞超微结构改变,免疫荧光染色检测神经元标志物Neu N及突触相关蛋白NF200和MAP2的荧光强度,Western blot检测各组细胞中NF200和MAP2蛋白表达水平。结果:XXMD在浓度为100 mg/L时细胞活力最强(P<0.05)。与对照组相比,模型组细胞变圆皱缩,线粒体呈现肿胀甚至空泡样改变,活力明显下降(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高(P<0.05),NF200和MAP2的荧光强度及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。而XXMD可改善细胞形态及超微结构,提升生存率(P<0.05),降低炎症因子水平(P<0.05)。免疫荧光染色及Western blot结果显示,与模型组相比,OGD/R+XXMD组可以增强NF200和MAP2平均荧光强度(P<0.05),提升蛋白表达水平(P<0.05)。结论:XXMD可以减轻OGD/R诱导的HT22细胞损伤,其机制可能涉及减轻炎症反应和增强突触可塑性。

丙酮酸钠对小鼠海马神经HT22细胞神经保护作用

目的研究丙酮酸钠(sodium pyruvate,SP)在低氧条件下对小鼠海马神经细胞HT22的神经保护作用。方法在低氧条件下,用MTS检测不同浓度SP孵育HT22细胞的活性变化;从形态学上,采用铁染色观察SP对HT22细胞的影响;应用溶酶体染色检测SP对HT22细胞的溶酶体变化;采用Western blot检测Bcl-2、Bax和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达。结果5 mmol·L^(-1)的SP能提高HT22细胞活力以及减少HT22细胞损伤;SP提高Bcl-2的表达,降低Bax的表达,使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加。结论在低氧的条件下给予SP可能通过减少HT22细胞凋亡,激活自噬发挥神经保护作用,从而降低低氧损伤。

红参-制何首乌药对抗衰老作用的HT22细胞和秀丽隐杆线虫模型初步研究

目的初步探讨不同提取工艺下红参-制何首乌药对对神经细胞的抗衰作用,为红参-制何首乌药对在抗衰及抗阿尔茨海默病(AD)作用的应用提供数据支撑。方法分别制备30%和70%乙醇回流提取物,30%和70%乙醇渗漉提取物和水提取物。通过流式细胞术检测不同提取物对HT22细胞中β-半乳糖苷酶含量的影响,初步筛选红参-制何首乌药对神经细胞抗衰效果最佳的提取物,并通过β-半乳糖苷酶染色直观分析该提取物对神经细胞的抗衰效果,用秀丽隐杆线虫寿命试验及瘫痪实验验证其抗衰及抗AD作用。结果红参-制何首乌药对的不同提取方式均对HT22细胞具有显著的抗衰老作用,其中70%乙醇渗漉提取物效果最佳。对其进行多浓度验证,显示具有剂量依赖性的保护作用。浓度为0.2 mg·mL^(-1)的70%乙醇渗漉提取物对秀丽隐杆线虫的寿命有明显的延长作用,浓度为0.008 mg·mL^(-1)的70%乙醇渗漉提取物具有缓解瘫痪的趋势。结论红参-制何首乌药对的70%乙醇渗漉提取物具有明显抗神经细胞衰老的作用,具有抗衰老延长寿命与治疗AD的潜力,应深入研究。

苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

大黄醇提物对氯化血红素诱导HT22细胞自噬和凋亡的影响

目的探究大黄醇提物对氯化血红素诱导损伤后HT22细胞自噬与凋亡的影响。方法将HT22细胞分为正常组、模型组和大黄醇提物高、中、低剂量组(25、12.5、6.25μg/mL),给药干预24 h后,以40μmol/L氯化血红素诱导3 h建立细胞脑出血损伤模型。造模结束后,CCK-8法检测细胞存活率,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞凋亡及自噬相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin1及P62表达。结果与正常组比较,模型组细胞存活率降低(P<0.01),LDH漏出率、细胞凋亡率和Bax/Bcl-2、caspase-3、Beclin1、LC3蛋白表达升高(P<0.01),P62蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较,大黄醇提物各剂量组细胞存活率升高(P<0.05,P<0.01),LDH漏出率、细胞凋亡率和Bax/Bcl-2、caspase-3、Beclin1、LC3蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),大黄醇提物高、中剂量组P62蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论大黄醇提物可能通过调节自噬与凋亡减轻细胞损伤,实现对神经元的保护。

抑制HDAC11减轻OGD/R所致的HT22细胞损伤

目的:探究组蛋白脱乙酰酶11(HDAC11)对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)致小鼠海马神经元HT22细胞损伤的作用,并从氧化应激/凋亡途径阐述其机制。方法:体外培养小鼠HT22细胞,在小鼠HT22细胞上筛选HDAC11抑制剂SIS17剂量安全范围。实验分为5组:对照(control)组,模型(OGD/R)组,低剂量(OGD/R+L)组,中剂量(OGD/R+M)组和高剂量(OGD/R+H)组。MTT法检测细胞存活率,微量酶标法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)及还原型谷胱甘肽(GSH)含量,水溶性四唑盐法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)含量,硫代巴比妥酸法检测细胞丙二醛(MDA)含量,流式细胞术及TUNEL染色检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞HDAC11,酪氨酸激酶(MerTK),caspase-12和Bax的蛋白表达水平。结果:相比于control组,OGD/R组细胞活力显著降低(P<0.05),LDH及MDA含量显著升高(P<0.01),SOD及GSH含量显著降低(P<0.01,P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.01),蛋白HDAC11,MerTK,caspase-12和Bax表达显著上调(P<0.05,P<0.01);相比于OGD/R组,OGD/R+M组及OGD/R+H组细胞活力显著增加(P<0.05);OGD/R+L组,OGD/R+M组及OGD/R+H组LDH显著降低(P<0.05,P<0.01);OGD/R+H组MDA水平显著降低(P<0.05),SOD及GSH显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05);OGD/R+H组HDAC11显著降低(P<0.05),MerTK表达显著升高(P<0.05),caspase-12表达显著降低(P<0.05);OGD/R+L组,OGD/R+M组及OGD/R+H组Bax表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:抑制HDAC11可改善OGD/R致小鼠HT22细胞损伤,其机制可能涉及减轻氧化应激和抑制细胞凋亡。

香萱解郁方对血清剥夺诱导HT22细胞损伤模型的神经保护作用

目的探讨香萱解郁方含药血清对血清剥夺致小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型的影响。方法采用血清剥夺培养HT22细胞建立神经损伤体外模型,实验分为对照组、模型组和中药组[中药组A(含药血清15%浓度)、中药组B(含药血清20%浓度)],各组血清剥夺12 h后,通过CCK8法检测各组细胞活力,确定15%浓度含药血清干预后细胞的存活率最高,设定为后续实验中药组的药物浓度。免疫荧光染色法检测神经元特异性微管蛋白(β-TubulinⅢ)在各组中的表达,蛋白质免疫印迹法及qPCR法检测脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白及其mRNA在各组中的表达。结果在加药后培养12 h,中药组的细胞活力明显高于对照组与模型组(P<0.001)。培养24 h,模型组细胞活力较对照组明显下降(P<0.001),中药组较模型组明显提高(P<0.001)。培养36 h,模型组细胞活力较对照组显著下降(P<0.001),中药组较模型组明显提高(P<0.001)。模型组BDNF蛋白含量及BDNF mRNA表达量较对照组显著降低(P<0.05,P<0.001),模型组少数神经元长出突起;中药组BDNF蛋白含量及BDNF mRNA表达量较模型组显著增加(P<0.05),中药组HT22细胞轴突突起长度和分支增加,β-TubulinⅢ阳性表达明显增多。结论香萱解郁方含药血清对血清剥夺诱导小鼠海马神经元HT22细胞损伤具有神经保护作用,可能与促进BDNF蛋白表达有关。

天麻蛋白对OGD/R诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制研究

目的研究天麻蛋白对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制。方法将体外HT22细胞常规培养,生长至对数生长期后铺板并随机分为对照组、OGD/R组、依达拉奉组、天麻蛋白组。以连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol·L^(-1)合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,继而恢复为无血清高糖DMEM培养2 h进行复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型。依达拉奉和天麻蛋白为自氧糖剥夺前24 h开始即加入相应药物终浓度,持续至复糖复氧结束。采用MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法测定LDH泄露率,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,丙二醛(MDA)含量及活性氧(ROS)水平,流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western blot检测OGD/R诱导损伤的HT22细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、Nrf2、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平变化。结果与对照组相比,OGD/R组细胞存活率下降(P<0.01),LDH泄露率升高(P<0.01),SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01),MDA含量及ROS水平增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达量下降(P<0.01),Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.01);与OGD/R组相比,天麻蛋白可提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH泄露率(P<0.01),提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.01),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01),上调HT22细胞中Bcl-2、p-AMPK、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白的表达量(P<0.01),有效抑制Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)。结论天麻蛋白对HT22细胞OGD/R损伤具有神经保护作用,其机制与活性氧/线粒体凋亡通路、AMPKNrf2通路和缺氧诱导因子通路相关蛋白密切相关。

巴利森苷A对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的HT22细胞的保护作用

目的:探讨巴利森苷A(PA)对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的HT22细胞的保护作用。方法:将HT22细胞随机分为6组,分别是空白组(Control组)、OGD/R组、依达拉奉(EDA)组、PA低剂量组(40μmol·L^(-1))、PA中剂量组(80μmol·L^(-1))、PA高剂量组(160μmol·L^(-1))。以连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol·L^(-1)合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,然后恢复为无血清高糖DMEM培养2 h作复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型。EDA和PA组自氧糖剥夺前24 h即加入相应药物的浓度,一直持续到复糖复氧结束。采用MTT比色法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞损伤率;采用试剂盒法检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、丙二醛(MDA)含量及细胞内的活性氧(ROS)水平;Western blot法检测各组细胞缺氧诱导因子通路相关蛋白HIF-1α和VEGF的表达水平。结果:与Control组相比,OGD/R组细胞肿胀,簇状聚集,细胞存活率下降(P<0.01),细胞损伤率升高(P<0.01),内源性抗氧化酶SOD活性下降,GSH-PX活性下降(P<0.01),氧化应激产物MDA含量增加,ROS水平增加(P<0.01)。与OGD/R组相比,PA给药组细胞形态较好,分布均匀,可提高细胞存活率(P<0.01),降低细胞损伤率(P<0.01),可提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.05),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),促进缺氧后HIF-1α和VEGF的蛋白表达(P<0.01)。结论:PA对OGD/R损伤的HT22细胞的氧化应激具有保护作用,其作用和调控缺氧诱导因子通路有关。

紫檀芪保护HT22细胞抗过氧化氢诱导凋亡的机制研究

目的探讨紫檀芪(PTE)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导HT22细胞氧化应激损伤的保护作用及调控机制。方法不同浓度的PTE处理HT22细胞12 h,并构建H_(2)O_(2)氧化应激损伤模型。CCK-8法检测细胞活力,比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量,TUNEL法染色检测细胞凋亡,DCFH-DA测定活性氧(ROS)水平,JC-1标记线粒体膜电位(MMP),并通过Western blot检测内质网应激和凋亡相关蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,PTE浓度小于10.0μmol/L时,HT22细胞活性无明显变化。H_(2)O_(2)可显著抑制HT22细胞活性,5.0μmol/L和10.0μmol/L PTE可有效增加损伤后细胞活性,减少LDH释放量,抑制凋亡及相关蛋白的表达,同时减少细胞内ROS,稳定MMP和细胞色素C分布。Western blot检测发现,PTE降低H_(2)O_(2)损伤后PERK和eIF2α的磷酸化水平以及下调Bip、CHOP的表达。结论PTE通过维持线粒体稳态、抑制内质网应激,进而减轻氧化应激诱导的细胞凋亡,最终发挥保护HT22细胞抗H_(2)O_(2)损伤的作用。

金丝桃苷对高糖诱导海马HT22细胞氧化应激介导的神经元凋亡的保护作用研究

目的探讨金丝桃苷(hyperoside,Hyp)对高糖(HG)诱导HT22海马神经元氧化应激及凋亡的保护作用及其可能的机制。方法采用CCK8法观察Hyp对HG诱导的HT22海马神经元增殖活力的影响;通过DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)水平;免疫荧光染色测定细胞线粒体膜电位(JC-1);Hoechst 33342染色和AV/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡;Western Blot测定p-Akt、p-GSK-3β、Caspase-3蛋白表达。结果Hyp在0~100μmol/L对细胞增殖活力没有影响,确定了100μmol/L以内是安全浓度范围,Hyp200μmol/L对细胞有损伤作用,低浓度25μmol/LHyp对HG损伤后细胞活力没有作用,50~100μmol/LHyp可明显提高细胞增殖活力;Hyp较HG组可明显抑制ROS产生,增加JC-1表达,而抑制剂TCBN组能阻断Hyp的作用;此外,Hoechst 33342染色和AV/PI凋亡检测结果显示,Hyp较HG组显著减少细胞凋亡,抑制剂TCBN组能阻断Hyp的作用,细胞凋亡增多;WB结果显示,Hyp较HG组显著增加p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达、降低Caspase-3蛋白表达,抑制剂TCBN组阻断了这种作用。结论Hyp能够抑制高糖诱导的HT22细胞氧化应激反应及凋亡,其作用可能与通过激活Akt/GSK-3β信号通路有关。

黄芪甲苷调控自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡

目的探讨黄芪甲苷通过调控自噬,对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响。方法将HT22细胞随机分为正常组(Control)、模型组(Model)、溶剂对照组(DMSO)、黄芪甲苷组(AS-IV)、黄芪甲苷组加正常细胞组(AS-IV+N)、黄芪甲苷加自噬抑制剂组(AS-IV+3-MA)、自噬抑制剂组(3-MA)、自噬激活剂组(Rapa)。除正常组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后复氧复糖。镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,LDH法检测细胞损伤,免疫荧光染色检测细胞凋亡。结果与正常组比较,模型组细胞胞体突触减少,细胞皱缩,细胞间连接减少;细胞存活率明显降低,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01)。与模型组比较,AS-IV组、Rapa组细胞存活率明显升高,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01);3-MA组细胞存活率明显降低,Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01);AS-IV+3-MA组无明显差异。结论黄芪甲苷可通过激活自噬,抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡。

RNA干扰高迁移率族蛋白1对Aβ25-35刺激HT22细胞中晚期糖基化终末产物受体/Toll样受体4信号通路相关蛋白表达的影响

目的研究RNA干扰高迁移率族蛋白1(HMGB1)对β淀粉样蛋白片段25-35(Aβ25-35)刺激HT22细胞HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、Tol样受体4(TLR4)、NF-κB、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等蛋白表达的影响。方法 Aβ25-350,2.5,5,10,20和40μmol·L-1作用HT22细胞24 h后,MTT法检测细胞存活,计算半数抑制浓度(IC50)。将对数生长期的HT22细胞分为5组:正常细胞对照组、Aβ25-3540μmol·L-1组、小干扰RNA(siRNA)50μmol·L-1组、siRNA或scramble siRNA+Aβ25-35组(HT22细胞转染si RNA或scramble si RNA 50μmol·L-1作用24 h后,再加入终浓度为40μmol·L-1人工合成的Aβ25-35处理24 h),显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光检测HMGB1在细胞中位置的改变,Western印迹法检测细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平。结果Aβ25-35作用HT22细胞24 h,IC50为41.17μmol·L-1。后续采用Aβ25-3540μmol·L-1进行实验。Aβ25-3540μmol·L-1作用24 h后,细胞大量死亡,聚集成团,突起减少,细胞间隙增大,且HMGB1从核内转移至核外。细胞内的HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65表达均显著升高(P<0.05),细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平显著升高(P<0.05);经siRNA 50μmol·L-1处理24 h,可显著降低细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达(P<0.05)及细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 RNA干扰HMGB1可减少Aβ25-35刺激HT22细胞HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达。

人参皂苷Rg_1对H_2O_2诱导的HT22细胞凋亡及胞内Ca^(2+)变化的影响

目的研究人参皂苷Rg_1对H_2O_2诱导的HT22细胞凋亡及胞内Ca^(2+)浓度变化的影响。方法以0、6.25、12.5、25、50、100μg/L人参皂苷Rg_1预处理细胞24 h,采用Ca^(2+)荧光染料探针Fluo-3/AM负载细胞1 h后,50 mmol/L H_2O_2刺激细胞,多功能酶标仪测定荧光强度,激光共聚焦显微镜实时监测[Ca^(2+)]i变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡。结果 H_2O_2可诱导细胞内Ca^(2+)浓度增加(P<0.01),并增加细胞凋亡率(P<0.01)。不同浓度人参皂苷Rg_1可呈剂量依赖性的抑制H_2O_2诱导的HT22[Ca^(2+)]i增加(P<0.01),抑制细胞凋亡(P<0.01),以50μg/L的作用为最强(P<0.01)。结论人参皂苷Rg_1可通过降低H_2O_2诱导的HT22细胞内Ca^(2+)水平的升高,抑制氧化应激引起的细胞凋亡。

β-淀粉样蛋白诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病细胞模型

目的 探讨β-淀粉样蛋白（Aβ25-35诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病（AD）细胞模型。方法 将HT22细胞分为未分化组和分化组,未分化组加入完全培养基培养48 h,分化组为完全培养基贴壁生长24 h后加入分化液（Neurobasal培养基和N2添加剂）培养24 h,Western印迹检测两组细胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表达量的变化。不同浓度的Aβ25-35别作用于两组HT22细胞24 h,用MTT测定细胞活力变化。结果ATF6、PERK、IRE1蛋白在未分化组的表达量明显高于分化组。Aβ25-35未分化组细胞虽有损伤作用,但各组间无明显差异,且无剂量依赖关系。Aβ25-35以诱导分化组HT22细胞发生损伤,且呈剂量依赖关系,Aβ25-3520μmol/L、40μmol/L）作用于分化组HT22细胞24 h,细胞存活率分别为66%、60%,AD模型最佳。结论 Aβ25-3520μmol/L）诱导分化型HT22细胞可建立最佳AD细胞模型。

天麻多糖对谷氨酸损伤HT22细胞的保护作用

目的研究天麻多糖对谷氨酸损伤HT22细胞的保护作用。方法 HT22细胞经50μg·ml-1谷氨酸孵育6 h损伤造模后,分别与12.5、25、50、100、200μg·ml-1天麻多糖共孵育24 h或与100μg·ml-1天麻多糖孵育3、6、12、24和48 h后,MTT法检测细胞活力,同时检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和活性氧簇(ROS)清除力。qRT-PCR检测兔抗鼠血红素加氧酶(HO-1)的mRNA水平,Western blot检测HO-1蛋白表达水平。结果谷氨酸可明显降低HT22细胞活性、SOD活性、ROS清除能力和HO-1的mRNA和蛋白水平。与谷氨酸孵育模型组比较,不同浓度天麻多糖可显著提高谷氨酸损伤HT22细胞活性(P<0.05,P<0.001).天麻多糖可同时明显恢复SOD活性和ROS清除能力(P<0.05或P<0.01),且具量效和时效关系。谷氨酸诱导下调的HO-1mRNA水平和蛋白表达水平明显回升。结论天麻多糖可减弱谷氨酸对HT22神经细胞的伤害,其机制可能与上调HO-1表达,改善细胞抗氧化能力有关。

低氧预适应对HT22细胞自噬的影响

目的:研究低氧预适应(HPC)对小鼠海马HT22细胞自噬的影响。方法:将HT22细胞并分为对照组(control)、低氧组(hypoxia)、低氧预适应组(HPC)和低氧预适应与3-甲基腺嘌呤联合处理组(HPC+3-MA)。MTS法检测HT22细胞活性,采用real time RT-PCR检测HT22细胞中自噬及微管相关蛋白1轻链3(LC3)mRNA表达,利用Western Blot检测LC3蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值变化,转染GFP-LC3进一步检测LC3Ⅱ表达。结果:HPC可增加低氧状态下HT22细胞的活性,与HPC组相比,HPC+3-MA组HT22细胞活性降低;HPC可以诱导低氧状态下HT22细胞中LC3的mRNA的表达,并增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值。结论:HPC通过促进低氧状态下HT22细胞自噬提高细胞活性。

缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞损伤的动态观察

目的探讨缺氧缺糖/复氧复糖不同时间点小鼠海马神经元细胞系HT22细胞损伤情况。方法取对数生长期的HT22细胞,随机分为6组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R) 0 h组(OGD/R 0 h)、缺氧缺糖/复氧复糖12 h组(OGD/R 12 h)、缺氧缺糖/复氧复糖24 h组(OGD/R 24 h)、缺氧缺糖/复氧复糖48 h组(OGD/R 48 h)、缺氧缺糖/复氧复糖72 h组(OGD/R 72 h)。除正常对照组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤情况,Bax、Bcl-2免疫荧光染色检测细胞凋亡情况。结果正常组HT22细胞呈两极或多极,突起明显,突起之间相互交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性强,OGD/R各组细胞胞体轴突减少,细胞皱缩,胞质凝聚。与正常组比较,OGD/R各组细胞存活率均显著降低(P<0.05),OGD/R 12 h至OGD/R 24 h达到最低(P<0.05);OGD/R 12 h及OGD/R 24 h组LDH显著升高(P<0.05),OGD/R 0 h、48 h、72 h组均有升高趋势。除OGD/R 0 h组和OGD/R 72 h组外,OGD/R各组Bax/Bcl-2比值均较正常组显著升高(P<0.05),峰值出现于OGD/R 24 h。结论缺氧缺糖/复氧复糖细胞损伤是一个复杂的动态过程,随着复氧复糖时间的延长,细胞损伤不断加重,24 h达到顶峰,随后细胞损伤情况逐渐缓解。

4-PBA通过抑制内质网应激降低七氟醚诱导的HT22细胞凋亡

目的:探讨七氟醚暴露后的神经细胞损害以及通过4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)抑制内质网应激对这种损害的保护作用。方法:以小鼠海马神经元来源的HT22细胞系为研究对象,将其分为对照组、七氟醚处理组、七氟醚+4-PBA预处理组。处理组在吸入性麻醉诱导箱中给予5%CO2和2%七氟醚麻醉处理5h,对照组只通入5%CO2,4-PBA预处理组则在麻醉前30 min给予4-PBA腹腔注射。检测内质网应激蛋白指标Bi P、p-IRE1以及活化的caspase12,并利用流式细胞法检测HT22细胞的凋亡情况。结果:(1)七氟醚诱导HT22细胞发生内质网应激,七氟醚处理后Bi P蛋白和IRE1的磷酸化水平明显升高,而4-PBA预处理组上述指标显著下降(P<0.01)。(2)七氟醚引起的HT22细胞凋亡能够被4-PBA抑制,流式细胞技术显示处理组细胞凋亡率明显大于4-PBA预处理组(P<0.01)。(3)内质网应激相关的caspase12激活介导了七氟醚引起的HT22细胞凋亡。统计学分析显示,处理组cleaved caspase12表达显著升高(P<0.01)。结论:吸入性麻醉剂七氟醚具有一定的神经毒性,内质网应激是其神经损害的重要机制之一。七氟醚能够通过诱导内质网应激而引起HT22细胞凋亡,而麻醉前给予4-PBA预处理可明显降低内质网应激反应,减少细胞凋亡,从而对七氟醚的神经毒性起到抵抗作用。

磷酸川芎嗪通过激活AMPK对HT22细胞在氧糖剥夺损伤中的保护作用

目的观察磷酸川芎嗪在离体水平对糖氧剥夺(OGD)诱导HT22细胞损伤的保护作用。方法磷酸川芎嗪(5、10、15μg/mL)预处理HT22细胞24 h,OGD处理4 h,HT22细胞分为空白对照组、模型组、5μg/mL磷酸川芎嗪组、10μg/mL磷酸川芎嗪组及15μg/mL磷酸川芎嗪组。CCK-8法检测HT22细胞存活率,荧光显微镜下观察神经元形态改变,利用荧光酶标仪检测各组细胞2-脱氧荧光葡萄糖(2-NBDG)的摄取能力,利用Western blot检测AMPK、p-AMPK蛋白表达。结果从细胞形态学上,磷酸川芎嗪对OGD损伤HT22细胞具有保护用;15μg/mL磷酸川芎嗪保护OGD诱导损伤的活性最大。对2-NBDG摄取量的影响,与剂量呈正相关。AMPK磷酸化随磷酸川芎嗪浓度的增加而增加。结论磷酸川芎嗪可能通过激活AMPK对HT22细胞在氧糖剥夺损伤中发挥重要的保护作用。