高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据 PRRSV HuN4 株基因组序列设计并合成 PRRSV 特异性引物,应用 RT-PCR 技术分6段扩增了 PRRS VHuN4 株全基因组 cDNA。将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于 pBlueScriptⅡSK(+)载体中构建了感染性重组质粒 pHuN4。并在病毒 cDNA5'末端引入 sp6 启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段 Poly(A)尾引入 NotⅠ酶切位点用于线性化 pHuN4;此外,将 HuN4 基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个 MluⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。pHuN4 通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在 Marc-145 细胞中救获病毒。结果显示:救获的病毒能够在 Marc145 细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异。利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100%,在感染后20d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得 PRRSV 强毒 HuN4 株感染性克隆,为从基因水平上研究 PRRSV 的致病机制提供了技术平台。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析

为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV)毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。

致弱过程中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株部分生物学特性的研究

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)弱毒疫苗,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株进行了致弱驯化,在Marc-145细胞上对其进行了3次蚀斑克隆和连续传代。该毒株的病变速度随着代次增高逐渐加快,传至80代以后其病毒滴度达到最高并保持稳定;电镜观察发现低代次病毒粒子形态以棒状为主,高代次病毒粒子形态以球形为主;蚀斑形态比较发现低代次病毒形成的蚀斑大小不一,而高代次病毒形成的蚀斑大小均一;序列分析和病毒抗原性分析表明HuN4株传代过程中GP5蛋白羧基端1个主要抗原表位(196QWGRL200)发生突变即196Q突变为196R,针对该表位的单克隆抗体只与HuN4株低代次病毒反应而不与高代次病毒反应。以上结果表明:在Marc-145细胞上经蚀斑克隆和连续传代致使HP-PRRSVHuN4株部分生物学特性发生改变,这些特性的改变在病毒弱化过程中的作用还有待进一步的研究。

高致病性PRRSV HuN4株不同代次病毒对仔猪胸腺损伤的研究

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstndural protein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11(749KGEPVSDQPAK759)能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变(S754)处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸(754SDQPAK759)C端缩短到第3个氨基酸(749KGEPVSDQ757)时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为753VSDQ756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65-11变异位点C754→S754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65-11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。

HP-PRRSV HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒对仔猪外周免疫器官及肺脏的损伤

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株在其致弱过程中对仔猪外周免疫器官及肺脏损伤的变化,试验分别采用HuN4F5及其致弱代次F15、F23、F30及HuN4弱毒疫苗F112感染30日龄PRRSV抗原抗体阴性健康断奶仔猪,每天进行体温测定及临床症状观察,并在感染后0,3,5,7,10天检测病毒血症情况。病毒感染后10天剖杀试验猪,观察外周免疫器官及肺脏的病理变化并对肺脏和主要外周免疫器官病毒载量进行测定。结果表明:HuN4 F5、HuN4 F15组在临床症状、病毒血症、外周病毒载量及病理变化方面都明显比其他组严重,HuN4 F23组发病明显减轻,HuN4 F30组、HuN4 F112组无明显发病特征,与空白对照组无明显差异。说明HP-PRRSV HuN4株在致弱过程中,传代至30代时毒力发生显著减弱。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4传代致弱株HuN4-F30感染性克隆的构建及拯救病毒致病性分析

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Hu N4株传代致弱株Hu N4-F30感染性克隆,本研究利用高保真DNA聚合酶,分6个片段进行病毒全基因组序列扩增,并通过点突变在其基因组10 808位引入Mlu I作为分子标记。通过重叠延伸PCR在5'端上游引入CMV启动子,3'端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和牛生长素多聚腺苷酸化信号(BGH)。将各片段依次连接克隆于改造的p Belo BAC11载体中,构建含有全长HP-PRRSV致弱株c DNA感染性克隆p Belo BAC11-Hu N4-F30,并将全长质粒直接转染Marc-145细胞拯救出病毒。通过核酸鉴定与测序、分子标记鉴定、间接免疫荧光试验和动物致病性试验等进行鉴定。结果表明,拯救的病毒能够通过Mlu I酶切与亲本鉴别,拯救病毒的间接免疫荧光与亲本病毒一致,拯救病毒表现出低致病性。HP-PRRSV Hu N4-F30感染性克隆的构建与病毒的拯救,为进一步研究HP-PRRSV传代致弱机制奠定了基础。

HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

应用高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗（HuN4-F112株）对28—30日龄的仔猪进行免疫，并定期采样检测，研究免疫后病毒血症持续时间和抗体消长规律，结果表明，病毒血症在免疫后第1周即可出现，最长可持续至免疫后第6周；疫苗免疫后，母源抗体明显下降，免疫后第3周平均阻断率最低为18％，此后开始上升，至免疫后第7周平均阻断率达到最高值85％，随后开始缓慢下降，至免疫后第16周时为54％。研究表明，HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后病毒血症持续时间最长为6周，抗体水平在免疫后第7周时达到最高。

猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上最佳增殖条件的研究

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HuN4-F112株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、收毒时间和病毒液冻融次数等条件。结果证明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量8%、细胞接毒密度1.5×105个/mL、pH7.1条件下生长状态最好;PRRSV HuN4-F112株的最佳接种剂量为3.0×105 TCID50/mL,收毒时间为接种后70～72小时,在-18℃冻融3次,PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。该结果为HuN4-F112株PRRSV疫苗的生产提供了依据。

PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。