HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3’UTR RNA与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础。方法根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达。结果经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体。通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光。嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达。结论成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株。

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因(HuR)的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。

RNA干扰HuR基因表达对急性髓系白血病细胞凋亡和CD7、CD19表达的影响及机制研究

目的:探讨RNA干扰抑制人抗原R(HuR)基因表达对急性髓系白血病细胞(AML)凋亡和CD7、CD19表达的影响及机制。方法:通过Lipofectamine 2000将具有干扰HuR表达的siRNA(HuR-siRNA组)及不具有干扰作用的siRNA(阴性对照组)转染AML细胞株THP-1,未转染的细胞为空白对照组,收集转染48h的细胞,western blotting检测各组细胞中HuR、CD7、CD19、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)、cleaved caspase-3、信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)及细胞周期D1(cyclin D1)的蛋白表达,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果:3组caspase-3和STAT3蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较,HuR-siRNA组HuR、CD7、CD19、p-STAT3和cyclin D1的蛋白表达量显著降低,cleaved caspase-3蛋白表达量和细胞凋亡率显著升高(P<0.05),阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:抑制AML细胞HuR基因表达可诱导细胞凋亡,降低CD7和CD19表达,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。

癌基因HuR调节胃癌功能的研究

目的:探讨癌基因HuR在胃癌组织的表达和对胃癌MGC-803细胞功能的影响。方法:使用RT-qPCR分析80例临床确诊的胃癌患者胃癌组织样本中HuR的表达水平;利用pSIH载体构建敲减HuR的重组质粒,实现HuR在MGC-803细胞中的低表达,以空载体pSIH作为对照;使用划痕实验检测细胞迁移能力,使用Transwell实验检测细胞侵袭能力,使用CCK-8法检测细胞活力。结果:RT-qPCR结果显示,与癌旁对照相比,67例(84%)胃癌组织中出现HuR的表达上调;低表达HuR能显著抑制MGC-803细胞的侵袭能力、迁移能力和活力(P<0.05),提示HuR作为癌基因起作用。结论:HuR的异常表达可能与胃癌的发生发展有关,低表达HuR可以抑制胃癌MGC-803细胞的侵袭、迁移和活力。

上调HuR基因对食管鳞癌细胞Kyse450放射敏感性的影响

目的研究HuR基因上调对于食管鳞癌细胞Kyse450放射敏感性的影响。方法慢病毒上调Kyse450细胞HuR基因,同时选取X射线6 Gy照射剂量作为干预条件。采用Western blot和qPCR技术分别检测Kyse450转染后的蛋白和RNA表达情况;CCK8试剂盒检测细胞的增殖速率;克隆形成试验检测细胞克隆形成能力;伤口愈合试验和Transwell试验检测细胞迁移能力的改变。结果CCK8试验显示HuR基因上调后细胞的增殖能力增强,放射后这种增强趋势更加明显;平板克隆试验显示随着放射剂量的增加,两组细胞的克隆形成率都随之降低,但是过表达组的克隆形成数多于对照组;伤口愈合试验以及Transwell试验表明过表达组的伤口愈合速率和迁移能力高于对照组,放射治疗后这种差异更显著;Western blot显示放射治疗后24 h过表达组细胞内MMP9、MMP2水平高于对照组。结论HuR上调会增强食管鳞癌细胞增殖、克隆、迁移能力,降低其放射敏感性。

HuR蛋白在胸腺瘤组织中的表达及意义

目的:检测HuR蛋白在胸腺瘤组织中的表达,分析其与胸腺瘤是否发生侵袭邻近器官及组织学分型的关系及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测HuR在50例胸腺瘤组织中的表达。结果:HuR的表达与胸腺瘤是否发生侵袭相关(P<0.05),无侵袭及有侵袭阳性率分别为40.91%及78.57%。HuR的表达与胸腺瘤的组织学分型相关(P<0.05)。结论:HuR在胸腺瘤细胞核中高表达可能参与了胸腺瘤的发生发展过程,有望影响胸腺瘤的术后治疗。