化风丹药母发酵过程中优势菌种分离鉴定及不同温度和pH值下菌株生长情况

目的对化风丹药母发酵过程中优势菌种进行分离鉴定,考察不同温度和pH值对优势菌株生长的影响。方法用选择性培养基对化风丹药母发酵过程中0周至6周样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、菌落计数、分离纯化优势菌种;采用16S rDNA,26S rDNA序列对优势细菌和真菌进行鉴定;分别考察阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉的最适宜生长温度、pH值。结果化风丹药母发酵过程中细菌0周至4周数量增加,4周至6周数量趋于稳定;酵母菌在发酵0周至3周时数量增加,4周至6周数量不断减少;霉菌在0周时没有生长,1周至4周数量平稳增加,5周至6周霉菌数量呈现下降趋势。通过构建系统发育树,鉴定筛选出化风丹药母发酵过程中的优势菌种,以阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉为研究对象,其生长的最适温度分别为35、25~30、35℃;最适pH值分别为8、6、7。结论化风丹药母发酵过程中优势微生物分别为阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉。

化风丹血清药物化学的初步研究

目的:对化风丹血清药物化学进行研究,初步探讨其药效物质基础。方法:采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法,同时建立化风丹提取物以及大鼠ig化风丹(6 g/kg)、药母(1.37 g/kg)、药母阴性样品(5.73 g/kg)提取物后含药血清的指纹图谱,分别在正、负离子检测模式下通过比较化风丹和含药血清的指纹图谱,初步鉴定化风丹在大鼠血中移行成分及其代谢产物。结果:在负离子模式下含药血清中共发现8个药源性成分(其中3个为原型成分,5个可能为代谢产物),有6个来自药母;在正离子模式下含药血清中共发现9个药源性成分(其中2个为原型成分,7个可能为代谢产物),有6个来自药母。结论:初步确定了化风丹的入血成分,其入血成分主要来自药母。

化风丹药母指纹图谱的建立及不同发酵时间样品中7种核苷类成分的含量测定

目的:建立化风丹药母的指纹图谱,并测定不同发酵时间样品中7种核苷类成分的含量。方法:采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为Pntulips BP-C18,流动相为甲醇-水(梯度洗脱),流速为0.8 mL/min,检测波长为260 nm,柱温为35℃,进样量为10μL。以黄嘌呤为参照,绘制12批化风丹药母的HPLC指纹图谱;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行相似度评价,确定共有峰;同法测定不同发酵时间(0、1、2、3、4周)样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷的含量。结果:12批化风丹药母共有8个共有峰,相似度为0.712~0.954;指认了7种成分,分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷。不同发酵时间样品中上述7种成分检测质量浓度的线性范围分别为0.87~8.7μg/mL(r=0.9996)、1.51~15.1μg/m L(r=0.9997)、6.08~60.8μg/m L(r=0.9995)、1.52~15.2μg/m L(r=0.9996)、1.82~18.2μg/mL(r=0.9996)、1.48~14.8μg/m L(r=0.9996)、1.63~16.3μg/mL(r=0.9993);定量限分别为0.0274、0.0763、0.2504、0.1723、0.1011、0.0783、0.0842μg/mL,检测限分别为0.0087、0.0255、0.0079、0.0841、0.0357、0.0269、0.0275μg/m L;精密度、重复性、稳定性(12 h)试验的RSD均小于3%;加样回收率分别为94.16%~100.16%(RSD=2.24%,n=6),93.87%~100.65%(RSD=2.67%,n=6),93.52%~99.66%(RSD=2.30%,n=6),93.67%~98.24%(RSD=1.89%,n=6),96.00%~102.18%(RSD=1.96%,n=6),94.62%~101.54%(RSD=2.82%,n=6),97.72%~104.56%(RSD=2.97%,n=6)。发酵0~4周时,上述7种成分及总核苷的含量分别为0.042~0.232、0.027~0.181、0.039~0.651、0.026~0.225、0.034~0.111、0.009~0.124、0.079~0.099、0.647~1.292 mg/g;发酵1~4周时的尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤及总核苷的含量均较发酵0周时显著升高,而尿苷、肌苷、鸟苷的含量较发酵0周时显著降低。结论:所建指纹图谱特征性强且操作简便,可用于化风丹药母的质量控制;含量测定方法准确、可靠,可用于同时测定其中7种核苷类有效成分的含量;化风丹药母中的核苷类成分含量受发酵时间的影响。

HPLC法测定化风丹药母在发酵过程中6个酯型生物碱的含量

目的:为控制化风丹药母的稳定性,探究化风丹药母在发酵过程中6个酯型生物碱的含量变化。方法:采用高效液相色谱法,选用色谱柱:Wondasil?C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:以0.1 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈-四氢呋喃,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长235 nm,柱温30℃。结果:在此色谱条件下,6个酯型生物碱成分可达到较好分离,苯甲酰新乌头碱,苯甲酰乌头碱,苯甲酰次乌头碱,次乌头碱,新乌头碱,乌头碱进样量分别在0.086 48~1.383 68μg、0.032 4~0.518 4μg、0.027 44~0.439 04μg、0.094 24~1.507 84μg、0.084 48~1.351 68μg、0.022 8~0.364 8μg范围内呈现较好的线性关系,精密度、稳定性、重复性均较稳定,平均加样回收率分别为97.1%、96.3%、95.2%、94.4%、93.4%、94.4%。发酵6周后,单酯型总生物碱含量变化为4.52%~7.36%,双酯型总生物碱含量变化为12.40%~6.35%。结论:通过发酵后,单酯型生物碱含量有所增加,双酯型生物碱含量有所降低,化风丹药母毒性降低。