怀中1号地黄中2-phenylethyl-beta-glucopyranoside通过调节PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α通路对低氧性肺动脉高压的影响

研究怀中1号地黄中2-phenylethyl-beta-glucopyranoside(Phe)对低氧诱导肺动脉高压小鼠的保护作用及其机制,为临床治疗肺动脉高压提供理论依据。首先将雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组,模型组,阳性药波生坦组(100 mg·kg^(-1)),Phe低、高剂量(20、40 mg·kg^(-1))组。除正常组外,其余各组均在10%的低氧环境中连续造模5周,并在第3周开始灌胃给药14 d,探究各组小鼠心肺功能、右心室压力、咳喘指数、肺部损伤、细胞凋亡、氧化应激相关指标、免疫细胞及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/缺氧诱导因子(hypoxic inducible facter,HIF)^(-1)α通路相关蛋白或mRNA水平。接着进一步采用缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)合并PI3K激动剂(740Y-P)对Phe干预肺动脉高压的机制进一步探究。结果显示Phe可显著提高肺动脉高压小鼠的心肺功能,降低右心室压力、咳喘指数及肺部损伤,减少细胞凋亡、氧化应激相关指标及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)入核水平,抑制HIF^(-1)α和PI3K mRNA与蛋白表达水平,并维持小鼠机体免疫细胞稳态。进一步的机制探究中发现,Phe显著降低缺氧诱导PASMC的细胞活力与迁移能力,减少HIF^(-1)α和PI3K蛋白表达及p-Akt、p-mTOR入核水平,且此作用可被740Y-P阻断。因此,推测Phe可通过减轻肺组织氧化应激失衡与凋亡,调节免疫水平来发挥抗肺动脉高压作用,其机制可能和调控PI3K/Akt/mTOR/HIF^(-1)α通路有关。该研究以期为肺动脉高压的治疗提供药物参考及研究思路。

怀中1号地黄不同炮制品中脂溶性成分比较及体外抗氧化活性研究

目的比较怀中1号地黄不同炮制品(鲜地黄、生地黄和熟地黄)中脂溶性成分的差异,并初步评价其体外抗氧化活性。方法采用索氏提取法获得地黄3种炮制品的脂溶性提取物,采用气相色谱-串联质谱法对其进行成分分析。采用NIST98系统谱库自动检索组分的质谱信息,结合有关文献和与八峰索引、EPA/NIH库对照对化合物进行结构鉴定,并使用Hewlett Packard软件按峰面积归一化法计算各化合物的相对含量。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法考察3种地黄炮制品中脂溶性成分的抗氧化活性。结果从地黄不同炮制品中共鉴定出79个脂溶性成分,从鲜地黄、生地黄和熟地黄中分别鉴定出48、52和37个脂溶性成分,其相对含量分别占总成分的92.69%、86.29%、92.89%;三者中共有脂溶性成分20个,其相对含量分别占各炮制品中脂溶性成分含量的88.73%、80.89%、85.87%,且均以亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、油酸甲酯等脂肪酸类成分为主。另外,鲜地黄中独有的脂溶性成分有18个,多为萜类化合物;生地黄和熟地黄中独有的脂溶性成分分别有17、6个,多为烷烃类化合物。抗氧化实验结果显示,三者中脂溶性成分对DPPH自由基的半数清除浓度分别为0.756、0.660、0.758 mg/mL。结论不同地黄炮制品中的共有脂溶性成分多为脂肪酸类化合物,鲜地黄中独有的脂溶性成分多为萜类化合物,生地黄和熟地黄中独有的脂溶性成分多为烷烃类化合物;其脂溶性成分均具有一定的体外抗氧化活性。

地黄多糖对慢性肾病大鼠冠脉平滑肌细胞自噬活性和TRPC1/6表达的影响

目的探究地黄多糖(RGP)对慢性肾病(CKD)大鼠冠脉平滑肌细胞自噬活性、经典瞬时受体电位蛋白(TRPC)1/6表达的影响。方法45只大鼠随机分为对照组、CKD组和CKD+RGP组,每组各15只。利用5/6肾切除法诱导CKD大鼠冠脉钙化。RGP(100 mg/kg,8周)通过灌胃干预。检测各组血清中血肌酐、尿素氮、钙、磷水平,冠脉钙化程度,以及冠脉平滑肌细胞中TRPC1/6和自噬标志蛋白(LC3B和Beclin1)的表达水平。结果CKD组和CKD+RGP组大鼠血肌酐和尿素氮水平比较差异无统计学意义(P>0.05),且均显著高于对照组(P<0.05);3组大鼠血清中Ca2+和磷水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。CKD组冠脉钙化水平和TRPC1/6蛋白表达水平显著高于对照组,LC3B和Beclin1蛋白水平显著低于对照组(P<0.05);CKD+RGP组冠脉钙化水平和TRPC1/6蛋白表达水平显著低于CKD组,LC3B和Beclin1蛋白水平显著高于CKD组(P<0.05);LC3B和Beclin1蛋白水平与TRPC1蛋白(分别为r=-0.532、r=-0.493)、TRPC6蛋白(分别为r=-0.601、r=-0.445)均呈负相关(P<0.05)。结论RGP缓解CKD大鼠冠脉钙化,抑制冠脉VMSCs中TRPC1/6蛋白的表达并促进自噬。

地黄多糖对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨地黄多糖对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人晶状体上皮细胞(HLEC)氧化损伤的保护作用及机制。方法取对数生长期的B-3细胞(HLEC)作为研究对象。筛选H_(2)O_(2)和地黄多糖最佳作用浓度。依据筛选的地黄多糖抑制H_(2)O_(2)致B-3细胞损伤的最佳作用浓度处理细胞,将B-3细胞分为:空白组、H_(2)O_(2)组和地黄多糖组。空白组:用10 g·L^(-1)羧甲基纤维素钠预处理细胞24 h后,换为EMEM培养基培养24 h;H_(2)O_(2)组:用10 g·L^(-1)羧甲基纤维素钠预处理细胞24 h后,换为含100 mol·L^(-1) H_(2)O_(2)的EMEM培养基培养24 h;地黄多糖组:用含40 mg·L^(-1)地黄多糖的培养基预处理细胞24 h后,换为含100 mol·L^(-1) H_(2)O_(2)的EMEM培养基培养24 h。采用扫描电镜和免疫荧光染色观察细胞焦亡情况;测定细胞活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及培养液中白细胞介素(IL)-1β、IL-18水平;Western blot检测NOD样受体蛋白3(NLRP3)/caspase-1途径相关蛋白表达水平。结果100 mol·L^(-1) H_(2)O_(2)和40 mg·L^(-1)地黄多糖为最佳作用浓度。扫描电镜结果显示:空白组细胞呈圆球形,边界规则;H_(2)O_(2)组细胞肿胀变大,边界不规则;地黄多糖组细胞肿胀程度减轻。与H_(2)O_(2)组相比,地黄多糖组切割消皮素D(GSDMD)-N阳性细胞数为每视野(5.33±0.46)个,GSDMD-N阳性细胞数显著减少(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,地黄多糖组B-3细胞ROS水平、MDA含量显著降低(均为P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,地黄多糖组培养液中IL-1β、IL-18含量降低(q=20.694、11.618,均为P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,地黄多糖组B-3细胞NLRP3蛋白表达水平及caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N/GSDMD均降低(均为P<0.05)。结论地黄多糖可减轻H_(2)O_(2)作用下B-3细胞的氧化损伤,其作用机制与抑制细胞焦亡有关。

不同种质地黄块根菊花心与非菊花心部位有效成分特征分析

目的：比较沁怀,85-5,北京1号,QH-1,1706,白选6种地黄生育期内菊花心与非菊花心中梓醇,毛蕊花糖苷,地黄苷A,D,益母草苷,多糖等指标性成分的含量,分析不同地黄种质资源菊花心的成分差异及质量特征,为地黄的质量评价及道地性揭示提供科学依据。方法：梓醇、毛蕊花糖苷含量测定参考2015年版《中国药典》;地黄苷A,D及益母草苷含量测定采用HPLC法,Dikma Diamonsil C_（18）色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相乙腈-水（4∶96）,流速1 mL·min^（-1）,检测波长205 nm,柱温30℃,进样量20μL;多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。结果：不同种质地黄块根各指标性成分在菊花心与非菊花心部位富集量差异很大。85-5与1706地黄菊花心部位中梓醇含量远高于非菊花心部位,而北京1号与QH-1地黄则是非菊花心部位明显高于菊花心部位;85-5,1706及QH-1地黄中毛蕊花糖苷在菊花心部位中的含量明显高于非菊花心部位,其他3个种质分布相对均匀;沁怀和北京1号地黄块根非菊花心部位中地黄苷A的含量明显高于菊花心部位;85-5,北京1号,1706地黄块根非菊花心部位中地黄苷D的含量均明显高于菊花心中的含量,其他种质差异不大;85-5,白选和1706地黄菊花心与非菊花心部位益母草苷含量差异不大,而北京1号,沁怀,QH-1地黄则为菊花心部位远高于非菊花心部位,差异达2~4倍;6种地黄块根非菊花心部位中的多糖含量明显高于菊花心部位。结论：种质在一定程度上决定了地黄块根次生代谢产物在地黄菊花心与非菊花心部位的积累与分布。

地黄的化学成分研究

目的研究地黄Rehmanniaglutinosa块根的化学成分。方法通过正相硅胶、SephadexLH-20以及反相HPLC柱色谱方法对地黄的化学成分进行分离纯化，应用谱学技术鉴定化合物的结构。结果从地黄块根乙醇提取物中分离得到29个化合物，分别鉴定为1，2，5，6-四氢-1-甲基-2-氧代-4-吡啶乙酸（1）、5-deoxyantirrhinoside（2）、5-deoxylamiol（3）、去乙酰野芝麻苷（4）、栀子新苷（5）、genipin-gentiobioside（6）、genamesideC（7）、68-hydroxy-2-oxabicyclo[4．3．0]△^8-9_nonen-l-one（8）、焦地黄素D（9）、焦地黄素E（10）、地黄苷（11）、sculponiside（12）、2-phenylethyl—O-β-9-xylopymnosyl-（1—6）-β-D—glucopyranoside（13）、毛蕊花糖苷（14）、红景天昔（15）、leueoseeptosideA（16）、焦地黄苯乙醇苷D（17）、deacyl-martynoside（18）、焦地黄苯乙醇苷A1（19）、焦地黄苯乙醇苷B1（20）、3，4-dihydroxy—p-phenethyl—O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→3）-O-β-D—galacopyranosyl-（1→6）-4-O—caffeoyl-β-D—glucopyranoside（21）、1-（4-methy-2-furanyl）-2-（5-methyl-5-ethenyl-2-tetrahydrofuranyl）-propan-1-one（22）、2-methoxy-4-methylphenyl-O-β-D—apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glueopyranoside（23）、rhamnopyranosylvanilloyl（24）、syringicacid-4·O-α-L-rhamnopyranoside（25）、（7R，8S,7＇R，8S,7＇4，9，4’，9＇-tetrahydroxy-3，3＇-dimethoxy-7，7＇-epoxylignan9-O-β—D-glucopyranoside（26）、1-methyl-1，2，3，4-tetrahydro-β—carboline-3-carboxylicacid（27）、异直蒴苔苷（28）、直蒴苔苷（29）。结论29个化合物包括9个环烯醚萜类（2-10）、11个苯乙醇苷类（11-21）和9个其他类型（1、22-29）化合物，其中化合物1为新化合物，命名为地黄啶，化合物2～8和24-29为首次从该属植物中分离得到。经体外活性筛选发现化合物1、4、13、15、24、25、27和28对D-半乳糖胺诱导的人肝细胞HL-7702损伤有较明显的保护作用。

地黄RgDXR基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR法对地黄DXR基因进行克隆,并用生物信息学方法分析其功能结构域、系统进化等;将地黄DXR基因克隆到原核表达载体p ET-32a上,使用大肠杆菌BL21菌株进行Rg DXR蛋白的原核表达及纯化,实时荧光定量PCR方法分析Rg DXR在不同组织、不同内生菌诱导下的表达特性。获得的Rg DXR基因c DNA全长为1 425 bp,编码474个氨基酸。生物信息学分析发现Rg DXR基因编码的蛋白质具有典型的DXR功能结构域,属于植物DXR基因家族。系统进化树分析表明,地黄Rg DXR与芝麻亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,栽培品种‘北京3号’根中Rg DXR表达量最高。内生真菌诱导实验表明,Rg DXR基因的转录水平与梓醇等环烯醚萜类物质的含量成正相关。本研究克隆所得的地黄Rg DXR基因属于DXR基因家族,推测其可能与地黄中环烯醚萜类物质的生物合成有关。