人肝细胞系L-02细胞单纯肝脂肪变性细胞模型的建立与应用

目的：探讨建立人肝细胞L-02单纯肝脂肪变性细胞模型的方法与模型的应用。方法体外用1640培养基培养L-02细胞，分为模型组和正常组。当细胞融合达到70%~80%，正常组换用新鲜1640培养液，而模型组改为含有游离脂肪酸（油酸和棕榈酸）混合物的1640培养基诱导培养24 h。以油红O染色定性观察细胞内脂滴并通过显色比较各组间总脂质差别，模型鉴定采用观察细胞内脂滴形态，检测细胞内甘油三酯和细胞培养上清丙二醛含量，并检测细胞凋亡情况；同时利用此模型观察护肝清脂片对脂肪变性肝细胞内脂滴的影响。结果模型组L-02细胞内脂滴大量形成，且甘油三酯明显升高，而培养液中肝酶释放量及丙二醛较正常组没有明显升高，且凋亡率没有明显增加；护肝清脂片含药血清两次给药，可以使细胞内脂滴和甘油三酯明显减少。结论采用油酸和棕榈酸混合物（油酸∶棕榈酸=2∶1）可以成功诱导L-02细胞脂肪变性，该模型适用于治疗脂肪肝药物的研究。

护肝清脂片药物血清对非酒精性脂肪肝细胞模型内质网应激的影响

目的探讨护肝清脂片药物血清对混合脂肪酸诱导的非酒精性脂肪肝HepG2细胞模型内质网应激(ER stress)的影响及其可能机制。方法油酸和棕榈酸以2∶1比例混合制备成1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)混合液,诱导HepG2细胞24 h发生脂肪变性,建立NAFLD体外模型,将HepG2细胞分为对照组(CON)、FFA组、护肝清脂片低剂量组(HG-L)、护肝清脂片中剂量组(HGM)、护肝清脂片高剂量组(HG-H)及非诺贝特阳性对照组(FF),在加入1 mmol/L FFA前分别加入各组对应的药物血清作用24 h,CON组及FFA组则加入大鼠空白血清作为对照。油红O染色观察细胞内脂滴分布;试剂盒检测细胞内甘油三酯(TG)含量及培养上清液谷草转氨酶(AST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)的水平;透射电镜观察细胞内质网形态结构的改变;Western blot、qRT-PCR技术检测ERS相关信号分子GRP78、PERK、p-PERK、ATF6、ATF4、XBP-1、CASPASE-12、CHOP、PKC-δ、p-PKC-δ蛋白及(或)mRNA的表达情况。利用siRNA瞬时转染技术沉默PKC-δ在HepG2细胞中的表达后观察GRP78、PERK、p-PERK、CASPASE-12和CHOP蛋白表达变化。结果与CON组相比,FF组HepG2细胞油红染色可见红色脂滴密布细胞质,TG、AST、ALT含量升高(P<0.001);与FF组相比,HG-L、HG-M、HG-H及FF均在不同程度上降低TG、AST、ALT含量,减少细胞内脂滴堆积,差异有统计学意义(P<0.05),并能够在蛋白及mRNA水平上有效地下调ERS相关信号分子GRP78、p-PERK、ATF6、ATF4、CHOP、CASPASE-12、XBP-1、PKC-δ、p-PKC-δ的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。在1 mmol/L FFA共同作用下,PKC-δsiRNA转染组GRP78、p-PERK、CHOP、CASPASE-12蛋白表达均较对照组明显下调,差异具有统计学意义(P<0.001)。然而,与PKC-δsiRNA+FFA组相比,PKC-δsiRNA+HG-H组GRP78和P-PERK表达下调更显著(P<0.001,0.01),CHOP和CASPASE-12则无统计学差异(P>0.05)。结论护肝清脂片药物血清可以有效地防治混合脂肪酸诱导的NAFLD细胞模型脂肪变性,改善HepG2功能状态,有效地缓解1 mmol/L游离脂肪酸所致的内质网应激,其作用机制在一定程度上与下调PKC-δ表达有关。