丹酚酸B抑制HuH-7细胞的Hippo/YAP通路机制研究

目的 探讨丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)对人肝癌HuH-7细胞是否具有抑制作用,并探讨其是否通过Hippo/YAP信号通路发挥作用。方法 采用TGF-β1 (9 pmol·L^(-1))或MST1/2抑制剂XMU-MP-1 (5、10μmol·L^(-1))刺激HuH-7细胞,用Sal B(50μmol·L^(-1))处理HuH-7细胞。用CCK-8和EdU检测细胞增殖情况,用细胞划痕实验检测细胞迁移情况,用免疫荧光染色法检测YAP和TAZ的表达和分布,用Western blot检测p-MST1、MST1、p-YAP、YAP、p-TAZ、TAZ和CTGF的蛋白表达水平。结果 Sal B抑制了TGF-β1或XMU-MP-1刺激的HuH-7细胞的增殖。同时,Sal B抑制了TGF-β1刺激的HuH-7细胞的迁移。值得注意的是,与XMU-MP-1对HepG2细胞迁移能力的促进作用不同,XMU-MP-1在本实验中不能明显促进HuH-7细胞的迁移。此外,Sal B可上调p-MST1、MST1、p-YAP、p-TAZ的蛋白表达,降低YAP、TAZ、CTGF的表达。结论 Sal B抑制HuH-7细胞的作用可能与激活Hippo/YAP信号通路有关。

虎杖苷上调miR-877-5p抑制肝癌Huh-7细胞增殖、迁移及侵袭

目的探讨虎杖苷对肝癌Huh-7细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养人肝癌细胞Huh-7,随机分组:对照组、低剂量虎杖苷组、中剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组;应用克隆形成实验、CCK-8法、划痕实验与Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移及侵袭;q RT-PCR法检测肝癌组织、癌旁组织与Huh-7细胞中miR-877-5p的表达量;E-cadherin、N-cadherin蛋白含量由Western blot法检测。结果相较于对照组,虎杖苷剂量依赖性的抑制细胞克隆形成数(分别为103.58±9.23、50.89±4.08,F=103.107,P=0.000),并通过促进E-cadherin蛋白表达(分别为0.16±0.02、0.55±0.05,F=187.778,P=0.000)抑制N-cadherin蛋白表达(分别为0.67±0.05、0.23±0.02,F=203.048,P=0.000)抑制细胞迁移(分别为71.96±5.94、28.12±2.54,F=164.192,P=0.000)和侵袭(分别为123.45±12.11、59.56±5.35,F=97.705,P=0.000);此外,虎杖苷刺激组细胞高表达miR-877-5p(分别为1.00±0.00、2.96±0.24,F=250.276,P=0.000),且成剂量依赖性。肝癌组织中miR-877-5p的表达量相较于癌旁组织显著降低(分别为1.00±0.08、0.32±0.03,t=55.712,P=0.000);miR-877-5p过表达相较于对照组被证实抑制肝癌细胞细胞克隆形成数(分别为108.41±11.37、59.33±5.12,t=11.808,P=0.000)、侵袭(分别为122.77±10.81、64.46±5.94,t=14.182,P=0.000)及迁移能力(分别为72.12±5.58、34.56±3.17,t=17.558,P=0.000);相较于虎杖苷+anti-miR-NC组,敲低虎杖苷刺激的肝癌细胞中miR-877-5p的表达可以逆转虎杖苷诱导的细胞克隆形成数(分别为48.52±4.50、89.23±7.88,t=13.459,P=0.000)、迁徙(分别为26.88±2.54、59.43±5.17,t=16.952,P=0.000)和侵袭抑制(分别为55.07±4.58、104.03±10.15,t=13.190,P=0.000)。结论虎杖苷可通过上调miR-877-5p表达而破坏肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

目的:探讨新补骨脂异黄酮(NBIF)对肝细胞癌(HCC)Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果:60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖(均P<0.01),光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加(P<0.01);WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达(均P<0.01)。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱(均P<0.01),GSDME-N蛋白表达受到抑制(P<0.01),显微镜下细胞肿胀、吐泡现象几乎消失,LDH释放明显减少(P<0.05)。结论:NBIF能够通过caspase-3/GSDME途径诱导Huh-7细胞发生焦亡,从而抑制HCC细胞的增殖,为HCC的治疗提供一种新思路。

circUBAP2靶向miR-2467-3p对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响

目的:探索circUBAP2靶向miR-2467-3p对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响。方法:qRT-PCR测定43例肝癌组织中circUBAP2和miR-2467-3p表达。在肝癌Huh-7细胞中转染si-NC(si-NC组)、si-circUBAP2(si-circUBAP2组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-2467-3p模拟物(miR-2467-3p组),或共转染si-circUBAP2+anti-miR-NC(si-circUBAP2+anti-miR-NC组)、si-circUBAP2+anti-2467-3p(si-circUBAP2+anti-2467-3p组),CCK-8和平板克隆实验测定细胞活性与克隆形成,Western blot测定cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡。双荧光素酶报告实验确定circUBAP2与miR-2467-3p的靶向关系。结果:43例肝癌组织中circUBAP2表达比癌旁组织升高,miR-2467-3p表达比癌旁组织减少(P<0.05)。circUBAP2和miR-2467-3p表达与肝癌患者病理级别、FIGO分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。干扰circUBAP2表达,Huh-7细胞活性和克隆形成数降低,cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达和凋亡率升高(P<0.05)。circUBAP2靶向调控miR-2467-3p表达。miR-2467-3p过表达提高肝癌Huh-7细胞cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达和凋亡率,降低细胞活性和克隆形成数(P<0.05)。下调miR-2467-3p表达逆转了干扰circUBAP2表达对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的作用。结论:干扰circUBAP2表达通过靶向miR-2467-3p促进肝癌Huh-7细胞凋亡并抑制其增殖。

健脾益气方对炎症微环境下人肝癌Huh-7细胞的增殖、侵袭及凋亡作用研究

目的探究健脾益气方对脂多糖(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)刺激下的构造的炎症微环境下人肝癌Huh-7细胞的增殖、侵袭及凋亡作用影响,并检测细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL^(-1)8的表达水平。方法构建健脾益气方含药血清,采用向细胞培养基中加入LPS与ATP共培养的方法刺激肝癌细胞并构建炎症微环境。将细胞分为空白组、模型组、VX-765组(10μmol·L^(-1))、低浓度中药组(15%健脾益气方低剂量含药血清)、中浓度中药组(15%健脾益气方中剂量含药血清)、高浓度中药组(15%健脾益气方高浓度含药血清)。细胞干预后采用CCK-8法检测各组细胞的增殖水平;通过Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡率;采用Transwell法检测各组细胞侵袭水平;采用PI单染色法检测各组细胞的周期水平;采用ELISA法、Western blot法检测Huh-7细胞中IL^(-1)b及1L^(-1)8表达水平。结果与空白组相比,采用LPS与ATP刺激后的模型组Huh-7细胞的增殖水平、侵袭水平与IL^(-1)β及1L^(-1)8表达水平更高(P<0.05),凋亡水平更低(P<0.05)。与其他组别相比,中浓度中药组与高浓度中药组能有效抑制Huh-7细胞的增殖水平与侵袭水平,阻滞细胞增殖周期,降低细胞存活率(P<0.05),并能显著诱导Huh-7细胞凋亡(P<0.05),并且降低Huh-7细胞中IL^(-1)β及1L^(-1)8表达水平(P<0.05)。结论中浓度及高浓度的健脾益气方含药血清能够通过改善肝癌Huh-7细胞中的炎症微环境实现对人肝癌Huh-7细胞的抑制增殖与侵袭,阻滞细胞周期和诱导凋亡作用,其作用机制可能与抑制肝癌细胞分析炎症因子IL^(-1)β及1L^(-1)8水平以实现对原发性肝癌的治疗目的。

稳定表达人ACE2的Huh-7细胞系的建立及应用

为了构建稳定表达人血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,hACE2)的Huh-7细胞系,本研究构建了不带荧光的pWPXL-neo-hACE2慢病毒载体,并利用psPAX2和pMD2.G-VSVG共同转染HEK293T细胞获得慢病毒;将包装好的慢病毒感染Huh-7细胞后,利用潮霉素B筛选获得可表达hACE2的Huh-7细胞;通过间接免疫荧光法和蛋白质印迹法检测Huh-7细胞中hACE2蛋白的表达;采用流式细胞术分析Huh-7-hACE2细胞与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)刺突(spike,S)蛋白受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD)的结合情况,并用SARS-CoV-2假病毒进一步测定Huh-7-hACE2细胞对SARS-CoV-2的易感性,最后利用鉴定过的Huh-7-hACE2细胞测定SARS-CoV-2中和抗体REGN10987对假病毒的中和效价。结果显示,hACE2蛋白在Huh-7细胞中成功表达,且表达的hACE2蛋白能与SARS-CoV-2 S蛋白RBD结合;相较于Huh-7细胞,Huh-7-hACE2细胞对假病毒的易感性显著提高,且假病毒中和效价测定结果与文献报道的真病毒中和效价相似。总之,本研究成功构建了稳定表达hACE2的Huh-7细胞系,并且其能应用于新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)治疗性单抗的活性评价,是研究SARS-CoV-2的致病机制、开发抗病毒药物及疫苗的有利工具。

芪灵扶正清解方对Huh-7细胞能量代谢及糖酵解相关蛋白的影响

目的 探讨芪灵扶正清解方(QFQ)对Huh-7细胞能量代谢及糖酵解相关蛋白的影响。方法CCK8法检测0、62.5、125、250、500μg/mL QFQ醇提物干预Huh-7细胞24、48和72 h后的细胞活力。将Huh-7细胞分为0、62.5、125、250、500μg/mL组,分别予相应浓度的QFQ醇提物干预24 h,应用细胞能量代谢分析仪检测线粒体和糖酵解ATP产生速率、实时耗氧率、胞外酸化率、糖酵解速率和质子流出速率;Western blot检测Huh-7细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、己糖激酶(HK)、葡萄糖转运蛋白(Glut)1以及Glut3的蛋白表达量。结果(1)与0μg/mL组比较,125、250、500μg/mL QFQ醇提物干预Huh-7细胞24、48和72 h后细胞活力明显降低(P<0.01)。(2)与0μg/mL组比较,62.5、125、250μg/mL组Huh-7细胞线粒体和糖酵解ATP产生速率比值明显提高(P<0.05),125、250μg/mL组Huh-7细胞糖酵解速率明显降低(P<0.05或P<0.01);与0μg/mL组比较,随着检测时间延长,62.5μg/mL组Huh-7细胞实时耗氧率呈升高趋势(P<0.05),250μg/mL组Huh-7细胞胞外酸化率和质子流出速率呈降低趋势(P<0.05)。(3)与0μg/mL组比较,62.5、125、250、500μg/mL组Huh-7细胞的HIF-1α、HK、Glut1、Glut3蛋白表达量均明显降低(P<0.01或P<0.05)。结论 QFQ通过调控细胞能量代谢和糖酵解相关蛋白HIF-1α、HK、Glut1和Glut3的表达,提高线粒体能力,抑制糖酵解能力,促进有氧呼吸,从而有效抑制Huh-7细胞的增殖。

miR-144-3p通过靶向FZD4阻断Wnt/β-catenin通路抑制肝癌Huh-7细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-144-3p通过阻断卷曲受体4(FZD4)/Wnt/β-catenin信号通路对肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制。方法:收集2012年3月至2017年7月在柳州市工人医院手术切除的18例肝癌患者的癌组织及相应的癌旁组织标本,以及肝癌细胞系Huh-7、SMMC7721和MHCC97和人正常肝上皮细胞株THLE-3,用qPCR检测肝癌组织及细胞系中miR-144-3p的表达水平。将miR-144-3p mimics/inhibitor和FZD4敲降载体转染至Huh-7细胞中,用CCK-8、Transwell、划痕愈合实验和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测Huh-7细胞的增殖、迁移和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因验证miR-144-3p和FZD4的靶向关系。结果:在肝癌组织和细胞系中miR-144-3p均呈低表达(P<0.05或P<0.01)。过表达miR-144-3p可显著抑制Huh-7细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡(均P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证明miR-144-3p靶向作用FZD4并下调其表达水平。体外实验进一步证实,过表达miR-144-3p靶向FZD4并阻断Wnt/β-catenin通路,进而抑制Huh-7细胞增殖、迁移和促进细胞凋亡(均P<0.01)。结论:miR-144-3p通过阻断FZD4/Wnt/β-catenin通路抑制肝癌Huh-7细胞的恶性生物学行为,为肝癌诊断或治疗提供了潜在分子靶点。

肝癌特异性靶标致敏DC诱导CIK细胞对肝癌HuH-7细胞及移植瘤的抑制

目的:观察负载肝癌特异性DC靶标的树突状细胞(dendritic cell,DC)与细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer cell,CIK)细胞共培养后对肝癌细胞HuH-7的杀伤作用以及对裸鼠肝癌移植瘤的治疗效果。方法:外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞。分别利用肝癌特异性DC靶标和肝癌HuH-7细胞冻融抗原刺激DC,ELISA法测定其对DC IL-12分泌的影响。DCHuH-7、DCtarget分别与CIK细胞共培养后,ELISA法检测其对CIK细胞IFN-γ分泌的影响,CCK-8法检测效靶比为10∶1、20∶1、40∶1、100∶1时DCHuH-7-CIK和DCtarget-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤作用。构建HuH-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、CIK组、DCHuH-7-CIK组和DCtarget-CIK组,尾静脉注射细胞悬液,观察效应细胞的抑瘤效果。结果:DCHuH-7与DCtarget的IL-12 p70分泌水平较DC显著升高[(179.33±14.04)、(173.33±6.66)vs(59.33±11.84)pg/ml,均P<0.01];与CIK细胞共培养后,DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK细胞分泌IFN-γ的能力也显著高于DC-CIK细胞(均P<0.01),且DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK细胞之间无显著差异(P>0.05)。在相同效靶比时,DCHuH-7-CIK细胞以及DCtarget-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤活性明显高于单纯CIK细胞(P<0.05),且DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK组之间无显著差异(P>0.05)。DCtarget-CIK细胞对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用与DCHuH-7-CIK细胞相仿,且均显著高于单纯CIK细胞[(78.48±14.58)%、(85.78±15.69)%vs(54.69±28.07)%,均P<0.05],无明显不良反应。结论:肝癌特异性DC靶标能够显著提高CIK细胞对HuH-7细胞及其裸鼠移植瘤的杀伤活性,可替代肝癌组织抗原负载DC。

毛花苷C促进肝癌细胞Huh-7凋亡并增强caspase-7的活化

目的研究毛花苷C对肝癌Huh-7细胞增殖的影响及其对caspase-7的活化作用。方法以不同浓度的毛花苷C作用于Huh-7细胞,通过细胞增殖抑制实验及克隆形成实验,检测毛花苷C对Huh-7细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检测其对Huh-7细胞凋亡的影响,并用激光共聚焦显微镜采集细胞凋亡染色图像;通过Western blot分析细胞凋亡蛋白caspase-7的活化水平。结果毛花苷C能明显抑制Huh-7细胞的增殖,实验组与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05),并呈量效依赖关系;通过流式细胞仪与激光共聚焦显微镜,观察到毛花苷C诱导凋亡细胞数增加;Western blot检测结果显示,毛花苷C可增强凋亡相关酶caspase-7的活化水平。结论毛花苷C明显促进肝癌Huh-7细胞凋亡并增强凋亡相关酶caspase-7的活化水平。

抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721和Huh-7中的表达及其编码序列扩增

目的检测抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7中的基因表达,扩增抑制素全长编码序列。方法分别提取肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7细胞总RNA,逆转录合成cDNA。使用Real time PCR,以GAPDH为内参检测抑制素的mRNA表达情况。采用RT-PCR方法扩增抑制素全长编码序列。结果 Real time PCR结果显示,SMMC-7721和Huh-7肝癌细胞株中均有抑制素的表达,且SMMC-7721细胞中抑制素表达量是Huh-7细胞中的6.652倍。RT-PCR方法扩增得到约835 bp的抑制素全长编码序列,条带特异,无非特异性扩增。结论人肝癌细胞株SMMC-7721中抑制素的表达量较高。

稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7细胞株的建立

目的为研究细胞周期相关因子PAK2在原发性肝癌中的作用,拟用shRNA干扰技术建立稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7肝癌细胞系。方法用基因转染技术将人PAK2的3个shRNA片段分别克隆至慢病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro,包装成病毒后利用脂质体将载体病毒转染至HUH-7细胞,利用G418筛选稳定表达shRNA的细胞。利用Real-time PCR和Western blotting方法分别鉴定转染细胞内PAK2的RNA及蛋白表达水平。结果sh1-PAK2 HUH-7、sh2-PAK2 HUH-7和sh3-PAK2病毒载体均可转染至HUH-7细胞系,且转染效率较高(>80%)。Real time-PCR结果显示,与对照组sh-cont比较,转染sh1-PAK2、sh2-PAK2和sh3-PAK可明显抑制HUH-7细胞内PAK2-mRNA的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中sh2-PAK2和sh3-PAK2的干扰效果尤为明显,下调效率分别达68%和89%。Western blotting结果显示,转染sh3-PKA2细胞内PAK2的蛋白表达量较对照组sh-cont明显下调,其表达量为对照组sh-cont的14.4%。结论稳定抑制PAK2基因表达的肝癌细胞系shPAK2 HUH-7的建立为PAK2在肝癌细胞中的作用机制研究奠定细胞基础。

CCR7对Huh-7肝癌细胞系增殖和侵袭的影响

目的探讨CCR7对肝细胞肝癌转移的影响。方法构建siRNA-CCR7载体,稳定转染表达CCR7的肿瘤细胞株Huh-7,用MTT法检测沉默CCR7基因对Huh-7肝癌细胞系增殖的影响,通过趋化侵袭实验检测其对肿瘤细胞株Huh-7趋化、侵袭能力的影响。结果通过抑制Huh-7细胞CCR7的表达,稳定转染siRNACCR7能有效抑制Huh-7细胞的增殖,并能抑制CCL21刺激的趋化和侵袭能力。结论沉默CCR7基因能有效抑制肝癌细胞增殖和侵袭性。

靶向CD24分子3E10增强肝癌HuH-7细胞的化疗敏感度

目的探讨靶向分子CD24单克隆抗体3E10调节肝癌HuH-7细胞对化疗药顺铂敏感度的作用及其分子机制。方法 Western blot和流式细胞术检测抗CD24抗体3E10的特异性;Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡;Real-time PCR和Western blot检测耐药基因和肿瘤干细胞特性基因的表达水平;Western blot检测JAK/STAT3和PI3K/AKT信号通路的活性水平。结果 3E10可有效识别CD24蛋白及HuH-7细胞。3E10显著增强HuH-7细胞对顺铂的敏感度(P<0.05),抑制率由(10.3±3.0)%提高至(34.4±10.8)%。3E10显著降低HuH-7细胞耐药基因ABCB1、ABCB5、ABCC1和肿瘤干性基因NANOG、CD24的表达水平及干性基因β-catenin的磷酸化水平(P<0.05)。3E10显著降低STAT3和AKT的磷酸化水平(P<0.05)。结论靶向CD24分子3E10通过降低HuH-7细胞的耐药性、肿瘤干性和JAK/STAT3、PI3K/AKT信号通路活性来增强HuH-7细胞对化疗药顺铂的敏感度。

HSV-tk联合GCV自杀系统对肝癌细胞株Huh-7杀伤作用的研究

单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessi mplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)基因,是目前研究比较多的自杀基因,其与前体药物丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)构成HSV-tk/GCV自杀基因系统。本实验将携带HSV-tk基因的慢病毒转染Huh-7细胞,通过报告基因反映慢病毒的转染效率;基因组PCR及RT-PCR检测转染Huh-7细胞中的HSV-tk基因的整合及表达;MTT检测不同浓度药物处理后的细胞存活率;最后HSV-tk+与HSV-tk-的Huh-7细胞以不同比例混合,MTT测定GCV作用后细胞的存活率。结果表明,HSV-tk/GCV系统作用于Huh-7细胞后,细胞出现明显的凋亡现象,旁观者效应比较明显。

Mithramycin A对肝癌细胞Huh-7增殖的影响

目的研究抗肿瘤抗生素光辉霉素(Mithramycin A,MIT)对人肝癌细胞Huh-7的作用。方法CCK-8比色法观察MIT对Huh-7细胞的生长抑制作用,Hoechst 33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果MIT可抑制Huh-7细胞的生长,半数抑制浓度(IC50)为60.12 nmol.L-1。荧光显微镜观察可见细胞凋亡特征性改变;浓度为5×10-2μmol.L-1的MIT作用72 h后,可明显诱导Huh-7细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。结论MIT对Huh-7细胞有明显的诱导凋亡和生长抑制作用,具有浓度、时间依赖性。

GPC3-siRNA真核质粒载体的构建及Huh-7细胞转染

目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

外源抗病毒基因沉默补偿性提高Huh-7细胞克隆HCV复制容许性

HCV在野生型人肝细胞瘤Huh-7细胞中复制效率低，但能在某些Huh-7细胞亚克隆中大量复制。我们在前面的研究中证明抑制HCV复制的细胞转录因子cAMP应答原件结合蛋白3样因子1的沉默允许HCV在Huh7细胞亚克隆HRP1细胞中的复制。

白英生物碱对人肝癌Huh-7细胞p38和Caspase-3表达的影响

目的探讨白英生物碱对人肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测白英生物碱对Huh-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测白英生物碱对人肝癌Huh-7细胞凋亡率的影响,蛋白印迹方法检测白英生物碱作用后细胞内凋亡相关蛋白的表达。结果白英生物碱能够抑制Huh-7细胞增殖,诱导Huh-7细胞凋亡,激活p38和Caspase-3蛋白。结论白英生物碱能诱导Huh-7细胞凋亡,其机制与调控p38和Caspase-3蛋白有关。