肝癌Huh7干细胞样细胞的富集培养及鉴定

目的：建立一种体外有效富集、培养和鉴定具有肝癌于细胞特征的细胞亚群的方法。方法：采用成球培养法利用肿瘤干细胞样细胞（cancerstemcell，CSC）分化培养基对肝癌Huh7细胞进行富集培养，获得的干细胞样细胞于体外进一步扩增获得肝癌干细胞球。流式细胞术检On,0Huh7干细胞样细胞表面肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD90和CDl33的表达，平板克隆集落形成实验和裸鼠成瘤实验分别检测Huh7细胞和Huh7干细胞样细胞的克隆集落形成能力、体内成瘤能力。结果：Huh7细胞成球培养3～7d后即可形成肝癌干细胞样细胞球，获得的干细胞样细胞具有自我更新和增殖能力，其EpCAM阳性细胞比例较Huh7细胞明显增加[（99．6％±0．31）％猫（0．12％±O．05）％，P〈0．01]，但两种细胞CD90[（0．11％±0．06）％US（0．09％±0．07）％，P〉0．05]和CDl33[（0．17％±0．08）％椰（0．15％±0．05）％，P〉0．05l表达差异无统计学意义。Huh7干细胞样细胞克隆集落形成数量明显多于Huh7细胞[（188．67±12．5）协（79±16．7）个，P〈0．01]；当接种量为5X10^4个细胞时，与接种Huh7细胞的对照裸鼠相比，接种Huh＇／干细胞样细胞的裸鼠成瘤时间更短（1I”s30d），成瘤率更高（100％郴16．67％）；接种5×10’数量级的细胞时，实验组成瘤体积[（171．90±10．94）伽（86．39±11．21）mm^3P〈0．01]和瘤体质量[（2．984±0．82）vs（0．324±0．17）g，P〈0．01]均明显大于对照组。结论：利用成球培养法能够从Huh7肝癌细胞系中富集培养获得Huh7肝癌干细胞，其具有比Huh7细胞更强的成瘤能力。

雷公藤红素增强多柔比星抑制肝癌细胞系Huh7细胞活性的实验研究

目的观察雷公藤红素增强多柔比星对肝癌细胞的杀伤活性及机制。方法设0.5、1、2μmol/L浓度的雷公藤红素为雷公藤红素1、2、3组,设0.1、1g/m L浓度的多柔比星为多柔比星1、2组;MTT法检测多柔比星单独治疗及联合雷公藤红素治疗对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。荧光定量PCR方法检测人正常胎肝细胞系L-O2及肝癌细胞系Huh7、Hep G2和PLC的PKM2表达水平。MTT法检测PKM2表达载体转染对雷公藤红素联合多柔比星杀伤Huh7细胞疗效的影响。结果与对照组Huh7细胞活力零抑制率比较,雷公藤红素1、2、3组分别为(2.6±0.9)%、(4.7±1.3)%(P均<0.05)、(8.8±1.9)%(P<0.05);多柔比星1、2组分别为(7.5±1.9)%、(61.4±4.2)%(P均<0.05);1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星较多柔比星1、2组,Huh7细胞活力抑制率明显上升[(58.7±3.8)%比(7.5±1.9)%,P<0.05;(89.7±6.7)%比(61.4±4.2)%,P<0.05]。PKM2相对表达水平,相对人正常肝细胞系L-O2细胞系的(1.0±0.05),Huh7细胞系为(15.2±0.6)(P<0.05),Hep G2细胞系为(11.8±0.5)(P<0.05),PLC细胞系为(13.4±0.7)(P<0.05);雷公藤红素1、2、3组分别下调为(0.70±0.05)(P<0.05)、(0.42±0.04)(P<0.05)、(0.31±0.03)(P<0.05);多柔比星组无下调作用;1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星后PKM2相对表达水平较多柔比星1、2组明显下降[(0.44±0.04)比(0.98±0.07),P<0.05;(0.41±0.03)比(1.01±0.07),P<0.05]。转染PKM2表达载体后,1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星对Huh7细胞活力抑制率较未转染组下降[(60.5±4.3)%比(19.3±2.0)%,P<0.05;(91.6±6.9)%比(69.6±4.5)%,P<0.05]。结论雷公藤红素通过下调PKM2的表达抑制肿瘤细胞的糖代谢,增强多柔比星对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。

FOXK1对肝癌高转移细胞系Huh7侵袭和迁移能力的影响

目的探讨叉头框转录因子1(FOXK1)对肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力的影响。方法采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测40例肝癌组织及其癌旁正常组织FOXK1 mRNA的表达,qRT-PCR和Western blot检测正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白的表达。小RNA干扰技术下调FOXK1表达后,qRT-PCR和Western blot检测肝癌高转移细胞Huh7 FOXK1 mRNA和蛋白的表达,Transwell实验检测其侵袭和迁移能力。结果 qRT-PCR检测结果显示,肝癌组织中FOXK1 mRNA的表达高于癌旁正常组织(2.87±0.21 vs 1.35±0.11,P=0.004);qRT-PCR和Western blot检测结果显示,相比正常肝细胞HL7702,肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.001)。下调FOXK1表达后,肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01),侵袭和迁移细胞数目明显减少(P<0.01)。结论下调FOXK1表达能抑制肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力。

环状RNA_0003028靶向微小RNA-498调控生殖器形成抑制基因-1/p53信号通路对人肝癌细胞系Huh7的影响

目的探讨环状RNA(circ)_0003028对人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法人肝癌细胞系Huh7分为小干扰RNA(si)-NC组、si-circ_0003028组、微小RNA(miR)-NC组、miR-498模似物(mimics)组、si-circ_0003028+anti-miR-NC组、si-circ_0003028+anti-miR-498组;Real-time PCR检测肝癌组织及各组细胞中circ_0003028和miR-498表达水平;MTT检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭数;Western blotting检测蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测circ_0003028和miR-498的靶向调控关系。结果肝癌组织中circ_0003028表达水平升高(0.98±0.02 vs 1.36±0.01),miR-498表达水平降低(0.98±0.02 vs 0.63±0.02)(P<0.05)。抑制circ_0003028表达或miR-498过表达后,Huh7细胞中Ki-67(0.85±0.02 vs 0.41±0.02或0.95±0.11 vs 0.37±0.02)、基质金属蛋白酶(MMP)-2(0.71±0.02 vs 0.43±0.03或0.83±0.02 vs 0.41±0.03)、MMP-9(0.74±0.02 vs 0.37±0.02或0.78±0.02 vs 0.39±0.02)蛋白表达水平降低,细胞活性(1.53±0.03 vs 1.05±0.02或1.68±0.02 vs 1.11±0.02)降低;迁移(111.40±2.12 vs 77.22±2.38或108.90±2.30 vs 78.44±1.46)和侵袭(87.89±2.18 vs 49.78±1.98或80.22±1.79 vs 38.22±1.52)细胞数减少,生殖器形成抑制基因-1(SMG-1)(0.76±0.02 vs 1.39±0.02或0.79±0.02 vs 1.39±0.02)、p53(0.77±0.02 vs 1.24±0.03或0.82±0.03 vs 1.45±0.03)、p53-ser15(0.78±0.03 vs 1.50±0.02或0.82±0.02 vs 1.49±0.04)蛋白表达水平升高(P<0.05)。Circ_0003028靶向调控miR-498,沉默miR-498逆转了抑制circ_0003028表达对Huh7细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结论抑制circ_0003028表达通过靶向miR-498影响SMG-1/p53信号通路而抑制人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

HBx蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响

背景与目的:肝癌组织内普遍存在着截短表达的HBx蛋白,这种蛋白可能与肝癌的发生有关,本研究探讨截短表达的HBx蛋白和野生型HBx对人肝癌细胞Huh7生物学行为的影响。方法:脂质体法介导HBx突变体和野生型HBx重组体转染HBV(-)的Huh7细胞。PCR方法扩增Neo基因检测质粒DNA片段插入。通过MTT、平板克隆形成实验、流式细胞仪和裸鼠成瘤实验检测稳定转染细胞的生物学活性。结果:HBx3′-20和HBx3′-40组细胞生长速度较HBx3′-30组明显增快(P<0.05);HBx3′-20组[(17.34±2.77)%]和HBx3′-40组[(18.36±2.61)%]克隆形成率明显较HBx3′-30组[(7.31±1.44)%]和pcDNA3组[(6.87±2.38)%]高(P<0.05)。细胞周期检测结果显示,对比于野生型HBx组,HBx3′-20组和HBx3′-40组蛋白的表达能加速Huh7细胞由G0/G1期到S期的进程[S期:(36.96±1.82)%vs.(46.20±3.23)%,(53.99±4.02)%,P<0.05],相反,HBx3′-10和HBx3′-30组则出现G1期阻滞,而HBx组与pcDNA3空载体组间[(38.60±1.15)%]在S期无明显变化。裸鼠成瘤实验显示,HBx3′-40组[(3.19±0.34)cm3]成瘤体积明显大于HBx3′-30组[(1.58±0.27)cm3]、HBx组[(1.75±0.15)cm3]和pcDNA3组[(1.67±0.12)cm3],各组瘤重存在显著性差异(P<0.01)。结论:对比野生型HBx组,HBx3′-20和HBx3′-40对Huh7细胞的生长具有明显促增殖作用,HBx3′-30组显示出抑制作用。HBx通过缺失突变修饰其生物学功能,在原发性肝癌发生、发展过程中起着重要作用。

银翘解毒软胶囊体外抑制人冠状病毒229E及其介导的炎症的研究

目的探究银翘解毒软胶囊(YQ)对人冠状病毒229E(HCoV-229E)的体外抑制作用。方法通过经典的体外细胞模型分析银翘解毒软胶囊的体外毒性及对HCoV-229E的抑制作用;通过空斑实验验证银翘解毒软胶囊对HCoV-229E的抑制作用;应用实时定量PCR法分析银翘解毒软胶囊对HCoV-229E介异的炎症因子表达水平的影响。结果银翘解毒软胶囊对人肝癌细胞的50%毒性浓度为(3 315±131)μg·mL^(-1),对HCoV-229E的50%抑制浓度为(361.9±36)μg·mL^(-1),选择指数为9.16。空斑实验表明银翘解毒软胶囊2 mg·mL^(-1)几乎可完全抑制病毒复制(P<0.001)。银翘解毒软胶囊在2 mg·mL^(-1)浓度作用下,可明显抑制由冠状病毒HCoV-229E感染介导的炎症因子如趋化因子(C-C基元)配体5(CCL-5,P<0.001)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1,P<0.001)、白细胞介素6(IL-6,P<0.001)、白细胞介素8(IL-8,P<0.001)和肿瘤坏死因子α(TNF-α,P<0.001)核酸的升高。结论体外实验显示银翘解毒软胶囊可抑制人冠状病毒HCoV-229E的复制及其介导的炎症反应,具有作为抗冠状病毒药物的开发价值。

Fc受体样4蛋白在肝癌组织中的表达及对癌细胞Huh7生物学行为的影响

目的探讨Fc受体样4蛋白(FCRL4)在肝癌组织中的表达及对癌细胞Huh7生物学行为的影响。方法选取本院肿瘤科冰冻肝癌肿瘤组织及其邻近癌旁正常组织各40份,免疫组化法测定癌旁组、肝癌组中FCRL4的表达水平。设Huh7细胞组、FCRL4mimics组、FCRL4inhibitor组,培养72h后,测定细胞活力、凋亡、侵袭水平,RT-PCR法及蛋白印迹法测定各组细胞FCRL4基因和蛋白水平。结果肝癌组FCRL4蛋白阳性率明显高于癌旁组(P<0.05)。FCRL4mimics组OD值、存活率、穿膜数、FCRL4 mRNA和蛋白水平高于Huh7细胞组,FCRL4inhibitor组OD值、存活率、穿膜数、FCRL4mRNA和蛋白水平低于Huh7细胞组和FCRL4inhibitor组(P<0.05)。FCRL4mimics组凋亡率低于Huh7细胞组,FCRL4inhibitor组凋亡率高于Huh7细胞组和FCRL4inhibitor组(P<0.05)。结论肝癌中FCRL4过表达,FCRL4过表达能促进Huh7癌细胞增殖、侵袭,抑制其凋亡。

CRISPR/Cas9系统靶向敲除多溴蛋白1基因对肝癌细胞功能的影响

目的探讨应用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统靶向敲除多溴蛋白1(PBRM1)基因对肝癌细胞功能的影响。方法应用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Huh7细胞的PBRM1基因。采用Sanger测序和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因敲除情况。基于转录本测序(RNA-seq)结果,对Huh7敲除(KO)细胞株与Huh7野生(WT)细胞系差异表达基因进行功能富集。采用流式细胞术分析细胞周期的改变。通过CCK-8法和克隆形成实验研究细胞增殖情况。采用不同浓度的γ-干扰素(IFN-γ)处理Huh7-KO细胞株和Huh7-WT细胞系,验证GO富集中IFN-γ应答通路的改变。结果成功构建PBRM1基因敲除的Huh7细胞株。Huh7-KO细胞株的生长曲线和克隆形成率均显著慢于Huh7-WT细胞系(P<0.0001)。Huh7-KO细胞株中下调基因主要与细胞周期相关,上调基因主要与免疫应答相关。Huh7-KO细胞株处于G1期的细胞比例明显高于Huh7-WT细胞系(P=0.0166),而处于S期的细胞比例明显低于Huh7-WT细胞系(P=0.0002)。浓度为1000 U/ml的IFN-γ对Huh7-KO细胞株组的细胞抑制作用明显高于Huh7-WT细胞系组(P=0.0091)。结论在Huh7肝癌细胞株中敲除PBRM1可以导致G 1/S阻滞从而抑制细胞增殖。高浓度IFN-γ可以更加有效地杀伤PBRM1缺失的肿瘤细胞。