RNA编辑酶ADAR1在Huh7.5.1细胞中抑制HCV复制的研究

目的:探究干扰素在Huh7.5.1细胞中对RNA编辑酶(adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1)表达的影响,以及ADAR1对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)复制的调控作用。方法:干扰素(IFN-α,30 IU/m L)刺激Huh7.5.1细胞后,利用real-time PCR和Western blot检测ADAR1表达水平的变化,同时HCV以一定滴度(0.2 MOI)感染Huh7.5.1细胞,观察IFN-α对HCV复制的影响;利用si RNA降低ADAR1表达,过表达质粒(ADAR1 p110和p150)增加ADAR1表达,并进一步利用基因编辑技术建立ADAR1稳定敲除细胞株,明确ADAR1与HCV的复制关系。结果:IFN-α诱导Huh7.5.1细胞ADAR1 p150表达(48 h:t=10.400,P=0.007;72 h:t=19.390,P=0.002),而不影响ADAR1 p110表达(48 h:t=0.806,P=0.472;72 h:t=1.929,P=0.133),同时IFN-α可显著抑制HCV复制(48 h:t=10.170,P=0.001;72 h:t=35.810,P=0.000)。ADAR1 p110和p150过表达48 h后,HCV病毒核酸和蛋白水平均明显低于空白对照(P=0.004,P=0.015);ADAR1 si RNA干扰后,HCV复制增加了2倍以上,差异显著(t=13.530,P=0.000);利用Crispr-cas9技术敲除掉Huh7.5.1中的ADAR1后,HCV复制也明显增加(t=5.259,P=0.023);ADAR1干扰后IFN-α仍然存在对HCV明显的抑制作用(t=9.146,P=0.001)。结论:IFN诱导蛋白ADAR1可以抑制HCV复制,且ADAR1部分介导了IFN-α对HCV复制的抑制。

顺铂联合迷迭香酸抑制Huh7细胞增殖诱导凋亡

目的:探讨含铂抗癌药物顺铂(Cisplatin, CDDP)联合中药单体迷迭香酸(Rosmarinic acid, RA)对人原发性肝癌Huh7细胞系增殖与凋亡的影响。方法:通过CCK-8细胞增殖实验检测并计算CDDP和RA治疗24 h、48 h、72 h后的IC50值,随后设置未经药物处理组(control组)、5μg/mL CDDP处理组、200μg/mL RA处理组以及5μg/mL CDDP联合200μg/mL RA处理组。采用流式细胞术检测control组、CDDP处理组、RA处理组以及联合用药组的细胞凋亡率分别为(7.28±0.56)%、(18.23±2.53)%、(26.44±1.99)%和(37.27±0.28)%。最后,利用免疫印迹试验(Western blot)检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3以及Procaspase-3凋亡相关蛋白的表达水平。结果:RA可增强CDDP对Huh7细胞增殖的抑制能力并呈现出浓度依赖性(P<0.05),在CDDP联合RA处理组中Huh7细胞的凋亡率显著升高(P<0.05),CDDP联合RA作用后促凋亡蛋白Bax与Cleaved-caspase-3的表达水平增加,而Bcl-2的表达水平下降(P<0.05)。结论:RA能抑制Huh7细胞增殖并且诱导细胞凋亡,与顺铂联用具有协同作用,其机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。

HepG2和Huh7细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR基因非编码单核苷酸多态性分析

目的:对HepG2和Huh7细胞中CYP3A4、CYP3A5和PXR基因的重要非编码单核苷酸多态性(SNP)进行分析。方法:提取HepG2和Huh7细胞基因组DNA,PCR后进行测序分析。结果:在HepG2细胞中CYP3A4 rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983都为突变杂合子;而在Huh7细胞中上述前4个SNP为野生纯合子,最后1个为突变纯合子。在这两种细胞中,CYP3A4 rs35599367、rs4646437、rs35564277都为野生纯合子,rs2740574为突变纯合子。在HepG2和Huh7细胞中CYP3A5 rs776746分别为突变杂合子和突变纯合子。在两种细胞中,PXR rs3814055、rs2276706、rs6785049为突变杂合子,rs13059232为突变纯合子。上述14个SNP中,HepG2细胞突变杂合子较多,而Huh7细胞野生纯合子及突变纯合子较多。结论:HepG2和Huh7细胞中CYP3A4、CYP3A5 SNP基因型不完全相同,而PXR SNP基因型相同。

顺铂联合迷迭香酸对Huh7肝癌细胞P21、P53和周期蛋白的影响

探讨顺铂(cisplatin, CDDP)联合迷迭香酸对人原发性肝癌Huh7细胞系P21、P53和周期蛋白表达的影响。方法 通过CCK-8细胞增殖实验检测并计算CDDP和RA治疗24h后的IC50值,随后设置未经药物处理组(control组)、5μg·mL-1CDDP处理组、200μg·mL-1RA处理组以及5μg·mL-1CDDP联合200μg·mL-1RA处理组。采用流式细胞术检测control组、CDDP处理组、RA处理组以及联合治疗组的细胞周期G2/M期分别为(16.87±4.98)%、(54.22±8.32)%、(23.01±5.78)%和(61.60±3.97)%。随后,利用免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测CyclinD1、CDK4以及CyclinB1周期蛋白的表达水平。最后,通过WB检测P21、P53蛋白表达水平。结果 CDDP联合RA可将Huh7细胞周期阻滞在G2/M期;CDDP联合RA后能促进CyclinB1蛋白的表达,降低CyclinD1和CDK4蛋白表达;CDDP联合RA后能促进P21和P53蛋白表达。结论 CDDP联合RA能将Huh7细胞周期阻滞在G2/M期,其机制可能与激活p53、p21表达有关。

miR-3612靶向SEMA4C调控肝细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-3612靶向信号素(SEMA)4C对肝细胞癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法:收集2020年5月至2021年9月间在皖南医学院第一附属医院弋矶山医院手术切除的肝细胞肝癌的40对癌组织和相应癌旁组织,常规培养肝细胞癌Hep3B和Huh7细胞,将其分为对照组、miR-3612 mimics-NC组、miR-3612 mimics组、miR-3612 inhibitor-NC组、miR-3612 inhibitor组、si-NC组、si-SEMA4C组、mimics-NC+pcDNA-NC组、miR-3612 mimics+pcDNA-NC组和miR-3612 mimics+pcDNA-SEMA4C组,用转染试剂将相应的核酸和质粒转染各组细胞。qPCR法检测miR-3612和SEMA4C mRNA在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中的表达,双荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀(RIP)实验验证miR-3612与SEMA4C的结合及调控关系,qPCR法和WB法检测转染后各组Hep3B和Huh7细胞中miR-3612、SEMA4C mRNA和蛋白的表达,CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测各组Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果:miR-3612在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中呈低表达(P<0.001),而SEMA4C则呈高表达(P<0.001),过表达miR-3612可抑制Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和vimentin、SEMA4C蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001),敲低miR-3612则促进Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和SEMA4C蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实miR-3612与SEMA4C可直接结合(P<0.001),miR-3612与SEMA4C的表达呈负相关也间接证明了这一点(P<0.001)。敲减SEMA4C能明显抑制Hep3B、Huh7细胞的增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05或P<0.01或P<0.001),过表达SEMA4C可逆转过表达miR-3612对Hep3B和Huh7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论:miR-3612通过调控SEMA4C表达影响Hep3B和Huh7细胞的恶性生物学行为,miR-3612有望成为临床肝细胞癌治疗的潜在靶点。

木犀草素对人肝癌细胞株增殖凋亡、迁移、糖酵解的影响及其机制

目的 观察木犀草素对人肝癌细胞株增殖凋亡、迁移及糖酵解的影响,并探讨其机制。方法 对体外培养的肝癌HepG2、Huh7细胞进行分组,对照组加入DMEM培养基处理,实验组分别用20、40、60、80、100μmol/L的木犀草素处理,采用CCK-8法测算细胞增殖率,细胞克隆形成实验计数细胞克隆形成细胞数,以评估细胞增殖能力;Western blotting法测算凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白)相对表达量,以评估细胞凋亡能力;细胞划痕实验测算细胞迁移率,以评估细胞迁移能力;试剂盒测定葡萄糖消耗量和乳酸生成水平,Western blotting法检测糖酵解相关蛋白(GLUT4、PDK1、HK2、PKM2、LDHA蛋白),以评估细胞糖酵解能力;Western blotting法检测LKB1/AMPK信号通路相关蛋白(LKB1/P-LKB1、AMPK/P-AMPK蛋白比值)。结果 与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞增殖率减小,且呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞克隆形成细胞集落数减少,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞Bax、Caspase-3蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞迁移率降低,且呈时间和剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞(除20μmol/L剂量外)葡萄糖消耗量减少,乳酸生成量增加,且呈剂量依赖性;与对照组比较,实验组HepG2和Huh7细胞GLUT4、PDK1、HK2、PKM2、LDHA蛋白相对表达量降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组LKB1/P-LKB1、AMPK/P-AMPK蛋白表达量比值升高,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。结论 木犀草素可抑制人肝癌细胞株的糖酵解过程,并进一步抑制细胞增殖、迁移和促进细胞凋亡,且呈剂量或时间依赖性,机制可能与其激活细胞内LKB1/AMPK信号通路有关。

肝癌Huh7干细胞样细胞的富集培养及鉴定

目的：建立一种体外有效富集、培养和鉴定具有肝癌于细胞特征的细胞亚群的方法。方法：采用成球培养法利用肿瘤干细胞样细胞（cancerstemcell，CSC）分化培养基对肝癌Huh7细胞进行富集培养，获得的干细胞样细胞于体外进一步扩增获得肝癌干细胞球。流式细胞术检On,0Huh7干细胞样细胞表面肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD90和CDl33的表达，平板克隆集落形成实验和裸鼠成瘤实验分别检测Huh7细胞和Huh7干细胞样细胞的克隆集落形成能力、体内成瘤能力。结果：Huh7细胞成球培养3～7d后即可形成肝癌干细胞样细胞球，获得的干细胞样细胞具有自我更新和增殖能力，其EpCAM阳性细胞比例较Huh7细胞明显增加[（99．6％±0．31）％猫（0．12％±O．05）％，P〈0．01]，但两种细胞CD90[（0．11％±0．06）％US（0．09％±0．07）％，P〉0．05]和CDl33[（0．17％±0．08）％椰（0．15％±0．05）％，P〉0．05l表达差异无统计学意义。Huh7干细胞样细胞克隆集落形成数量明显多于Huh7细胞[（188．67±12．5）协（79±16．7）个，P〈0．01]；当接种量为5X10^4个细胞时，与接种Huh7细胞的对照裸鼠相比，接种Huh＇／干细胞样细胞的裸鼠成瘤时间更短（1I”s30d），成瘤率更高（100％郴16．67％）；接种5×10’数量级的细胞时，实验组成瘤体积[（171．90±10．94）伽（86．39±11．21）mm^3P〈0．01]和瘤体质量[（2．984±0．82）vs（0．324±0．17）g，P〈0．01]均明显大于对照组。结论：利用成球培养法能够从Huh7肝癌细胞系中富集培养获得Huh7肝癌干细胞，其具有比Huh7细胞更强的成瘤能力。

Chk1基因沉默增强姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的敏感性

背景与目的:Chk1和Chk2有望成为肿瘤放化疗增敏的新靶点,然而,Chk1/2能否作为姜黄素治疗肿瘤的增敏靶点却很少有研究报道。本研究旨在探讨Chk1/2小干扰RNA(siRNA)对姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的影响,评价其作为姜黄素治疗肝癌增敏靶点的有效性。方法:Western blot方法检测姜黄素对肝癌细胞Huh7中细胞周期检测点信号通路蛋白的影响;RT-PCR和Western blot方法检测Chk1/2siRNA对Chk1/2mRNA和蛋白的沉默效果;DAPI核染色法分别检测Chk1/2siRNA抑制Chk1/2表达后姜黄素诱导Huh7细胞凋亡的情况;流式细胞术检测Chk1/2表达被沉默后姜黄素对Huh7细胞周期的影响。结果:姜黄素明显抑制细胞周期检测点信号通路蛋白Chk1(S317),Cdc25C(S216)和Cdk1(Y15)蛋白的磷酸化水平;与si-NC转染组相比,Chk1/2siRNA使细胞中Chkl和Chk2mRNA水平分别下降了95%和60%,蛋白水平分别下降了92%和55%(P<0.01);抑制Chk1使姜黄素诱导的细胞凋亡率由(21.3±1.8)%上升到(29.5±2.6)%(P<0.05),抑制Chk2并无此作用;Chk1/2siRNA对姜黄素处理后的Huh7细胞周期均无明显影响。结论:Chk1siRNA能有效提高姜黄素诱导Huh7细胞的凋亡率,提示Chk1可能作为姜黄素治疗肝癌的有效增敏靶点。

核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

目的:探讨核心蛋白聚糖(decorin,DCN)对HuH7细胞系体外增殖的影响及机制。方法:加入不同浓度(0、25、50、75、100、125、150、200μg/L)的DCN培养HuH7细胞系不同时间(12、24、48、72h和2周),用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力,流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。结果:DCN浓度增加及作用时间延长,细胞增殖速度减慢、活力减低,G1期细胞增多,凋亡增加。结论:DCN可能为一种负性调控蛋白,可通过调节细胞周期,抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡。

pSG5/NS5A5BΔC质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的:构建pSG5/NS5A5B△C质粒,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达。方法:使用已经构建的pTM1-NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5A5B△C基因片段,将目的片段插入pSG5载体中,经筛选阳性克隆、SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后,用FuGene6转染试剂转染入Huh7细胞。用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达。结果:限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致。荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上。West-ern blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82ku)一致的条带。结论:成功构建了pSG5/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础。

HCV NS5B在人肝癌细胞系Huh7细胞内的表达及活性分析

目的为靶向抗HCV药物筛选奠定基础。方法使用脂质体将包含HCV非结构蛋白5B(NS5B)基因的重组载体pcDNA-5B转染至人肝癌细胞系Huh7细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot鉴定NS5B mRNA和蛋白表达,采用荧光素酶试验检测NS5B细胞内RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性。结果转染的Huh7细胞出现1.8kb的特异性NS5B mRNA目的带及一条相对分子质量约66 kD的蛋白目的带,且后者具有细胞内RdRp活性。结论人肝癌细胞系Huh7细胞可成功表达具有细胞内RdRp活性的NS5B,以其为靶标的抗HCV药物可为临床治疗提供新思路。

利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶可调控高表达的Huh7肝癌细胞

目的利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶(sphingomyelin synthase,SMS)可被Dox调控高表达的Huh7细胞,为进一步探讨SMS活性升高致动脉粥样硬化的机制打下基础(建立细胞模型)。方法首先将Tet-Off调控质粒转染Huh7细胞构建Huh7-tTA细胞,然后再将含外源性人SMS基因(hSMS)的PTREE2hyg质粒转染Huh7-tTA细胞,经分离纯化成功构建可调控表达hSMS的Huh7单克隆细胞(命名为SMS细胞,SMS1和SMS2)。为了便于检测外源性hSMS,利用FLAG标记hSMS(SMS-FLAG)。结果 SMS细胞表达SMS-FLAG受不同剂量Dox调控,SMS mRNA测定结果显示:0 ng/mL Dox剂量组较0.01 ng/mL和100 ng/mL Dox组均有显著升高(P<0.05和P<0.001);0.01 ng/mL Dox组较100 ng/mL Dox组也有显著升高(P<0.05)。SMS蛋白测定结果相似于SMS mRNA结果。SMS酶活性测定结果显示0 ng/mL Dox组显著高于100 ng/mL Dx组(P<0.001),而对照组(Huh7-tTA)1、00 ng/mL Dox组和野生型Huh7细胞组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用Tet-Off体系成功构建SMS高表达可调控Huh7细胞,SMS细胞SMS高表达受Dox剂量调控。

高表达CD81的Huh7细胞株对提高HCV病毒感染效率的研究

目的建立具有高感染性的丙型肝炎病毒(HCV)的体外细胞株。方法构建高表达CD81的Huh7细胞株。将HCV质粒(JFH-1,2a)体外转录成RNA,电转染到Huh7和CD81-Huh7细胞中,实时定量PCR法检测两组细胞和培养上清液中病毒载量,间接免疫荧光法检测细胞中HCV核心蛋白表达。收集电转后细胞上清液重新感染两组细胞,检测细胞中病毒RNA表达。结果 CD81-Huh7电转后,细胞和上清液中病毒RNA水平均明显高于Huh71-2log。其被感染的效率也高于Huh7。结论成功建立一株能够高表达感染性HCV病毒颗粒的细胞株CD81-Huh7。

甲胎蛋白与Caspases3在Huh7肝癌细胞中共表达的意义

目的:确定Caspases3与甲胎蛋白(AFP)共表达于Huh7细胞中,为肝癌的治疗提供新思路。方法:取对数期Huh7肝癌细胞,提取总RNA,经反转录成cDNA,经PCR扩增,并行琼脂糖电泳检查、照相。结果:Caspases3与AFP共表达于Huh 7肝癌细胞中。结论:其于此理论提出了治疗肝癌的新思路。

表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达。方法以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物。首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A(B1-1)(L80Q),pSG5/M-H05-5(B2-1)/4A(B2-1)(V51A),pSG5/M-H05-5(B2-2)/4A(B2-2)(S61A)。然后,分别以A1-2,B2-1,B2-2为模板,再将第80位的赖氨酸点突变为谷氨酸(L80Q),构建另外3个双点突变质粒:pSG5/M-H05-5(B1-2)/4A(B1-2),pSG5/M-H05-5(A2-1)/4A(A2-1)和pSG5/M-H05-5(A2-2)/4A(A2-2)。每个质粒均进行序列测定验证点突变成功。用FuGene6转染试剂将构建物转染入Huh7细胞,并应用间接免疫荧光试验和Western blotting检测构建物的表达。结果免疫荧光实验检测到NS3的4种亚细胞定位方式:点状,弥漫样,面包圈样,及短棒状。Western Blotting亦显示构建物均成功表达,同时发现A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象,表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1NS3 in cis丝氨酸蛋白酶活性较弱。结论成功构建表达不同氨基端二级结构HCV NS3/4A点突变质粒,为抗不同亚型HCV的深入研究提供基础。

蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响及机制研究

目的:探讨蛇床子素对人肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响,并初步探究其作用机制。方法:采用不同浓度(0,2.5,5,10,20,40μg·ml^-1)的蛇床子素干预人肝癌Huh7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50);10μg·ml^-1蛇床子素联合不同照射剂量(0,2,4,6,8 Gy)的X射线处理Huh7细胞,MTT检测细胞增殖能力,筛选照射剂量;克隆形成实验检测Huh7细胞放射敏感性变化,分别采用10μg·ml^-1蛇床子素、4 GyX射线照射及两者联合干预Huh7细胞,流式细胞术检测Huh7细胞凋亡率,Western Blot检测Huh7细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved caspase-9)的表达水平。结果:蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖有明显抑制作用,IC50为20.14μg·ml^-1;与单纯照射组相比,蛇床子素联合不同剂量X射线照射下均能够明显抑制细胞存活率,筛选出4 Gy剂量用于后续放射实验。与单纯照射组相比,蛇床子素联合照射组Huh7细胞的放射敏感性、Huh7细胞凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:蛇床子素能够抑制肝癌Huh7细胞增殖,促进细胞凋亡,并增强细胞对放射的敏感性,其作用机制可能与蛇床子素上调cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达有关。

去甲斑蝥素诱导人肝癌Huh7细胞凋亡和周期阻滞的机制研究

目的研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对人肝癌Huh7细胞毒性及作用机制。方法10~100μmol/L去甲斑蝥素干预人肝癌Huh7细胞后,甲基噻唑蓝法检测去甲斑蝥素对Huh7的细胞毒性;46μmol/L去甲斑蝥素干预人肝癌Huh7细胞后,倒置显微镜下观察Huh7细胞的形态学变化,流式PI染色法检测细胞凋亡和细胞周期的变化,蛋白印迹实验检测Huh7细胞中p53和p21蛋白的表达水平。结果去甲斑蝥素能时间和剂量依赖性地抑制Huh7细胞的生长。与对照组比较,46μmol/L去甲斑蝥素作用Huh7细胞24小时后可使细胞出现皱缩变圆,体积变小等形态改变;去甲斑蝥素可时间依赖性诱导细胞凋亡和G_(2)/M周期阻滞(P<0.05),上调p53、p-p53和p21蛋白的表达。结论去甲斑蝥素可能通过激活p53和p21蛋白诱导Huh7细胞发生细胞凋亡和G_(2)/M期周期阻滞。

表儿茶素对H_2O_2引起的Huh7细胞氧化应激的作用

目的:探索表儿茶素对H2O2引起的Huh7细胞氧化应激的作用及其机制。方法:对H2O2和表儿茶素干预培养的Huh7细胞,应用MTT法检测细胞存活率,荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)生成量,免疫印迹测定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt),增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA),磷酸化应激激活的c-Jun蛋白水平。结果:0.8mmol/LH2O2孵育1h可诱导显著Huh7细胞损伤,细胞存活率下降到(40±3.2)%,ROS生成量比未处理细胞多5.4倍。细胞经150μmol/L表儿茶素与H2O2共孵育后,细胞存活率提高到(94.5±9.84)%;表儿茶素能显著抑制H2O2引起的Huh7细胞ROS生成,ROS生成下降60%(P<0.01)。表儿茶素抑制H2O2引起Huh7细胞死亡和ROS生成随剂量增加抑制作用加强。表儿茶素抑制H2O2激发Huh7细胞磷酸化c-Jun表达,提高细胞Akt、PCNA水平。结论:表儿茶素抑制H2O2引起的Huh7细胞氧化应激损伤而导致的细胞死亡,其作用机制是通过减少细胞内活性氧生成,抑制H2O2激活磷酸化c-Jun,提高细胞Akt,PCNA水平。

雷公藤红素增强多柔比星抑制肝癌细胞系Huh7细胞活性的实验研究

目的观察雷公藤红素增强多柔比星对肝癌细胞的杀伤活性及机制。方法设0.5、1、2μmol/L浓度的雷公藤红素为雷公藤红素1、2、3组,设0.1、1g/m L浓度的多柔比星为多柔比星1、2组;MTT法检测多柔比星单独治疗及联合雷公藤红素治疗对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。荧光定量PCR方法检测人正常胎肝细胞系L-O2及肝癌细胞系Huh7、Hep G2和PLC的PKM2表达水平。MTT法检测PKM2表达载体转染对雷公藤红素联合多柔比星杀伤Huh7细胞疗效的影响。结果与对照组Huh7细胞活力零抑制率比较,雷公藤红素1、2、3组分别为(2.6±0.9)%、(4.7±1.3)%(P均<0.05)、(8.8±1.9)%(P<0.05);多柔比星1、2组分别为(7.5±1.9)%、(61.4±4.2)%(P均<0.05);1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星较多柔比星1、2组,Huh7细胞活力抑制率明显上升[(58.7±3.8)%比(7.5±1.9)%,P<0.05;(89.7±6.7)%比(61.4±4.2)%,P<0.05]。PKM2相对表达水平,相对人正常肝细胞系L-O2细胞系的(1.0±0.05),Huh7细胞系为(15.2±0.6)(P<0.05),Hep G2细胞系为(11.8±0.5)(P<0.05),PLC细胞系为(13.4±0.7)(P<0.05);雷公藤红素1、2、3组分别下调为(0.70±0.05)(P<0.05)、(0.42±0.04)(P<0.05)、(0.31±0.03)(P<0.05);多柔比星组无下调作用;1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星后PKM2相对表达水平较多柔比星1、2组明显下降[(0.44±0.04)比(0.98±0.07),P<0.05;(0.41±0.03)比(1.01±0.07),P<0.05]。转染PKM2表达载体后,1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星对Huh7细胞活力抑制率较未转染组下降[(60.5±4.3)%比(19.3±2.0)%,P<0.05;(91.6±6.9)%比(69.6±4.5)%,P<0.05]。结论雷公藤红素通过下调PKM2的表达抑制肿瘤细胞的糖代谢,增强多柔比星对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。

pSG5/TRIF质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的构建pSG5/Myc-TRIF质粒,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达。方法首先用NotⅠ酶切既往构建的pCX4pur/Myc-TRIF质粒,平末端化,然后用EcoRⅠ酶切,获得TRIF片断。用SmaⅠ和EcoRⅠ先后酶切空载体pSG5。各酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。与预期吻合后,电泳回收靶片段。行连接反应。经筛选阳性克隆,扩大培养、提取、纯化重组质粒。BamHⅠ酶切鉴定重组质粒pSG5/Myc-TRIF。分别用FuGene6转染试剂和重组牛痘病毒(rVV)预感染后用Lipofectin转染重组质粒入Huh7细胞。用免疫荧光染色、Westernblot检测pSG5/Myc-TRIF的表达。结果经限制性内切酶BamHⅠ酶切后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致。转染后,荧光显微镜下可见Huh-7细胞表达Myc-TRIF蛋白,而且用rVV预感染后Lipofectin转染较用FuGene6转染表达率大大提高。Western blot结果显示在转染pSG5/Myc-TRIF的Huh7细胞中,均出现了大小约100ku的条带。rVV预感染后用Lipofectin转染较FuGene6转染表达量高,与免疫荧光染色结果一致。结论成功构建了pSG5/Myc-TRIF质粒。用rVV预感染Huh7细胞后再用Lipofectin转染重组质粒可以提高表达效率。