惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析

根据红色原鸡IFN A基因设计了引物对 ,采用PCR法克隆并测序了我国地方标准品种惠阳胡须鸡的IFN α基因 ,定名为HyIFNA4。HyIFNA4与红色原鸡类IFN α比较 ,ORF长度均为 582个核苷酸、编码 162个氨基酸 ,相互间同源性在 97 4 %～ 99%。

鸡II型干扰素存在亚型

采用 RT- PCR法从惠阳胡须鸡克隆了 II型干扰素基因 ( Ch IFNγ2 )。Ch IFNγ2是含 1 9个氨基酸的信号肽和 1 45个氨基酸的成熟蛋白 ,与已报道的鸡 II型干扰素基因( Ch IFNγ)长度一致 ,核苷酸和氨基酸同源性分别为 97%和 92 .7% ;有 1 2处氨基酸发生点变异。 Ch IFNγ2与禽类 IFNγ和哺乳动物IFNγ在氨基酸水平上同源性分别为 6 2 .2 %～ 92 .7%和 2 6 .5 %～ 31 .8%。 1 980年国际干扰素命名委员会建议 ,在一特定的干扰素型别内 ,氨基酸序列或组成方面有差异时可确定为亚型。根据这些规定 ,惠阳胡须鸡Ch IFNγ2可被定为一种新亚型的鸡 II型干扰素。即

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。

惠阳胡须鸡IFN-α基因的克隆 表达和重组蛋白的抗病毒活性圆二色性分析

IFN-α是一种具有很强抗病毒活性的细胞因子。从惠阳胡须鸡肝脏克隆了IFN-α基因,为新的亚型。将IFN-α成熟肽与毕赤酵母pPICZαA连接,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后确定目的基因无突变并且插入方向正确,将重组质粒转化到GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达,重组IFN-α分子量约为35kD,表达量达到了0.307mg/ml,在CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性为3.2×106U/mg。圆二色实验结果表明IFN-α重组蛋白中含有53.2%α螺旋、3.1%β折叠、10.6%转角和33.1%无规谱卷曲,属于全α型蛋白。结果表明,采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-α,并首次证实鸡IFN-α属于全α型蛋白。

16SrDNA克隆文库方法分析两纯系鸡回肠及盲肠黏膜细菌的组成

以1日龄纯系的优质肉鸡A系(♂,A组)和惠阳胡须鸡(♂,B组)为试验动物,研究比较两纯系鸡28日龄回肠与盲肠黏膜菌群的组成及多样性。于第28日龄分别从2组中采集鸡2个肠段并提取黏膜细菌基因组DNA,应用16S rDNA基因序列技术,建立2个肠段黏膜细菌16S rDNA V3区的随机克隆文库。回肠文库分析发现,A组文库有86个序列共产生6个OTUs()perational taxonomic units),其已知序列主要属于肠球菌属、乳杆菌属、粪球菌属及梭菌属类序列,而B组文库有97个序列共产生2个OTUs,主要属于梭菌类序列;盲肠文库分析发现,A组文库有93个序列共产生44个OTUs,其优势菌群是未分类瘤胃球菌属(18.28%)、粪球菌属(13.98%)、拟杆菌属(10.75%)、Blautia(10.75%)及未分类毛螺菌属(7.53%);B组文库有97个序列共产生42个OTUs,其优势菌群是普拉梭杆菌属(17.53%)、粪球菌属(11.34%)、拟杆菌属(9.28%)及未分类瘤胃球菌属(8.25%);2组盲肠文库中其他菌属的数量存在较大差异,且未发现与大肠杆菌相关的序列。优质肉鸡A系和惠阳胡须鸡28日龄回肠与盲肠黏膜细菌的组成差异明显,尤其是瘤胃球菌属与产丁酸菌的组成比例,这种差异可能是宿主遗传的影响所致。

惠阳胡须鸡LPL、FASN基因多态性的研究

以惠阳胡须鸡为研究对象,分别以LPL、FASN基因为脂肪性状相关的候选基因,采用限制片段长度多态性(RFLP)检测这2个候选基因在惠阳胡须鸡中的多态性。研究结果表明,(1)用限制性内切酶HinfⅠ对LPL基因第8内含子进行RFLP分析,发现76.3%为已报道的BB型,另发现了两种新的基因型,分别占1.7%和22%,无AA型;(2)用限制性内切酶HaeⅢ对FASN基因进行RFLP分析,发现BB基因型比例为64.8%,BC型12.24%,CC型基因型比例23.4%。B等位基因频率为0.7041,C等位基因频率为0.2959,B等位基因频率明显高于C等位基因频率。

惠阳胡须鸡IGF-Ⅰ和GHRL基因多态性研究

以IGF-Ⅰ和GHRL基因为惠阳胡须鸡生长性状的候选基因,通过测序、酶切等方法对93日龄惠阳胡须鸡IGF-Ⅰ和GHRL基因多态性进行分析,并用GLM模型分析基因型与体质量的关联性。结果表明:IGF-Ⅰ基因在第181位发生碱基突变,A突变为G,属于同义突变,BsmⅠ酶切分析发现,IGF-Ⅰ基因只有1种基因型,表明该位点在胡须鸡保种群中已经纯合;GHRL基因在第124位发生碱基突变,T突变为G,改变了酶切位点,通过pfl MⅠ酶切分析发现,GHRL基因有3种基因型,即AA型、AB型和BB型。统计结果表明,93日龄惠阳胡须鸡3种基因型个体间体质量无显著差异。

惠阳胡须鸡微卫星多态性研究

为进一步保护和利用惠阳胡须鸡遗传资源,监测保种场保种效果,随机采集96只惠阳胡须公鸡血样,提取总DNA,选用18对微卫星标记进行PCR扩增,并对其基因片段进行扫描,利用Pop Gen 32软件分析扫描结果,结果表明,18个微卫星标记在惠阳胡须鸡群中均表现出较高的多态性,平均等位基因数为10.61个,平均杂合度H为0.5963,平均多态信息含量PIC为0.74。说明惠阳胡须鸡保种群体具有丰富的遗传多样性,具有较大的选育潜力。

惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFN-β基因的克隆与序列分析

克隆了惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFNβ-基因,与G enbank上白色来航鸡IFNβ-序列核苷酸同源性分别为99.84%和100%,没有形成新的亚型。二级结构预测表明鸡IFNβ-与IFNα-都是全α螺旋蛋白,但α螺旋的长度和组成螺旋的氨基酸上有差别;BLA ST结果表明其三级结构与人IFNβ-的三级结构最为相似。这对于理解IFNα-、IFNβ-与其受体结合方式的不同与他们的生物学活性差异之间的关系奠定了基础。

惠阳胡须鸡中A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性的研究

本研究旨在通过分析与脂肪性状相关的A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性,找出优势基因型个体即保持胡须鸡的肉质口感又能克服生长速度慢的特点,为下一步的基因型选择提供理论基础。本实验以惠阳胡须鸡作为实验材料,从鸡血液中提取DNA,通过PCR扩增、测序等分子生物学技术分析了A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性。结果表明:1)A-FABP基因发现了两处碱基突变,一个在第1685碱基处由C突变T,但由于不在编码区,没有氨基酸的改变,而另一个在第1830碱基处缺失了G,引起编码氨基酸的改变即缺失了D(天冬酰胺),进而导致蛋白质空间结构发生改变。2)H-FABP基因发现两个碱基突变,其中一个突变位点不在编码区,没有相应氨基酸改变,而另一个在第746碱基处由A突变为G,使得编码的氨基酸由赖氨酸变成谷氨酸,导致蛋白质空间二级结构发生改变。这些结果说明在惠阳胡须鸡中,A-FABP和H-FABP基因存在单核苷酸多态性,为下一步的基因型选择奠定了理论依据。

惠阳胡须鸡肌纤维直径、密度生长发育规律的研究

已有研究表明,肌纤维组织特性是反应肉品质的一个重要指标.本研究旨在通过对不同日龄惠阳胡须鸡肌纤维组织特性的研究,了解惠阳胡须鸡肌纤维的生长规律,为以后指导惠阳胡须鸡的生产实践提供理论依据.实验选取了不同日龄惠阳胡须鸡的胸肌、腿肌组织块制作成石蜡切片,对肌纤维直径与密度进行测量,统计分析.结果表明,不同日龄惠阳胡须鸡胸肌、腿肌肌纤维的直径和密度间存在显著性差异(P<0.05).随着日龄的增加,惠阳胡须鸡胸肌、腿肌肌纤维直径不断增大,肌纤维密度不断减少.

中草药对惠阳胡须鸡肌纤维直径和密度的影响分析

肌纤维直径和密度是反映肌肉品质的一个重要指标。为了解在基础日粮中添加不同中草药对惠阳胡须鸡肌纤维直径和密度产生的影响,试验选取100日龄体重相近的惠阳胡须鸡128只,随机分成4组,每组4个重复,每个重复8只鸡。4组分别饲喂基础日粮、基础日粮+2.5%绿茶粉、基础日粮+3%桑叶粉、基础日粮+2%大蒜粉。预试验7 d,正式试验42 d。试验结束,每组随机选取12只鸡宰杀,取胸肌制成石蜡切片,统计分析各组的肌纤维直径与密度。试验结果表明:对照组胸肌肌纤维直径、密度与绿茶粉添加组、大蒜粉添加组、桑叶粉添加组差异不显著(P>0.05)。综上,日粮中添加桑叶粉(3%)、绿茶粉(2.5%)和大蒜粉(2%)对惠阳胡须鸡胸肌肌纤维直径和密度没有直接的影响。

3种植物添加剂对惠阳胡须鸡肌肉氨基酸、脂肪酸组成与含量的影响

本试验旨在研究绿茶粉、桑叶粉和大蒜粉对鸡肌肉中氨基酸、脂肪酸含量和组成的影响,为植物添加剂在惠阳胡须鸡生产中的应用提供理论依据。选取120只120日龄体重相同、健康的惠阳胡须母鸡,随机分成4个处理,每个处理3个重复,每个重复10只。试验Ⅰ组,饲喂基础日粮+2%绿茶粉;试验Ⅱ组,饲喂基础日粮+4%桑叶粉;试验Ⅲ组,饲喂基础日粮+1.5%大蒜粉;对照组,饲喂基础日粮,预试验7d,正式试验30d。饲养试验结束后,每个处理随机选取10只鸡进行屠宰。每只屠宰鸡取同一部位胸肌100g,通过氨基酸自动分析仪测定肌肉中氨基酸的组成和含量,通过气相色谱仪测定肌肉中脂肪酸的组成和含量。试验结果表明:(1)日粮中添加植物添加剂对肌肉中氨基酸的组成没有影响,但对肌肉中氨基酸的含量有影响,试验组必需氨基酸含量均显著高于对照组(P<0.05);(2)日粮中添加植物添加剂对肌肉中脂肪酸的组成没有影响,但对肌肉中脂肪酸的含量有影响,对照组总饱和脂肪酸含量显著高于3个试验组(P<0.05),而3个试验组总多不饱和脂肪酸含量/总饱和脂肪酸含量的比值显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果表明,日粮中添加植物添加剂不影响肌肉中氨基酸和脂肪酸的组成,但影响肌肉中两者的含量,显著降低鸡肌肉中饱和脂肪酸的含量,提高多不饱和脂肪酸的比例,增加必需氨基酸含量。因此,日粮中添加植物添加剂可改善惠阳胡须鸡肌肉品质。

不同日龄惠阳胡须鸡肌肉中IGF1、MyoD基因表达研究

已有研究表明,IGF1(胰岛素样生长因子1)、MYOD(肌分化因子)基因在肌细胞的生长、增殖、分化上具有重要的调控作用.本研究以在惠阳胡须鸡为研究对象,采集不同日龄(86、155、213、300、394、454)的惠阳胡须鸡的胸肌和腿肌,然后通过提取RNA、反转录、聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR分析了这两个基因在不同日龄惠阳胡须鸡的胸肌和腿肌中的表达情况.半定量结果发现,MYOD基因只在86日龄的腿肌中表达,而IGF1基因在不同日龄的胡须鸡胸腿肌中均有表达,而荧光定量PCR的结果显示IGF1基因在胸腿肌的相对表达量存在差异,但没有达到显著性.这些结果为深入了解IGF1基因在鸡肌纤维生长发育过程的作用提供了新的证据.