Purification and characterization of human anti-HBsAg Fab fragment produced by genetic engineering technology

Objective: To obtain pure human monoclonal antibody (mAb) Fab fragments against HBsAg with good biological activity by genetic engineering technology. Methods: The specific anti-HBsAg phagemid was selected from established combinatorial library and transfected into E. coil XL1-blue. Its expression was induced by isopropyl β-D- thiogalactopyranoside (IPTG). The crude Fab supernatant was obtained after E. coli cells were frozen at - 20℃ and thawed repeatedly along with centrifugation. The goat anti-human IgG Fab was prepared by immunizing the goat with purified human IaG Fab. The affinity chromatography column with goat anti-human IgG Fab and GammaBind Plus Sepharose was obtained. The crude Fab super- natant was purified with affinity chromatography and the purity was assessed with SDS-PAGE and Western-blot, and biological activity was evaluated by Dot-blot test. Results: SDS-PAGE of the purified Fab displayed a side band, verified to be the Fab band by Western-blot test. Dot-blot test demonstrated that the purified Fab fragments posses good affinity to HBsAg. Conclusion: The success in purification of human anti-HBsAg Fab fragments with good biological activity makes it possible to be used as future therapeutic agents.

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab (rhFab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸 ,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附 ,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化 .采用自制金属 (铜、锌金属离子 )螯合层析介质 ,以 pH和咪唑两种洗脱方法 ,对rhFab段的纯化效果进行了探讨 .结果显示 :铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rhFab的亲和能力更强 ;pH洗脱方法的重复性优于咪唑法 ;金属铜离子螯合层析法对rhFab进行一步纯化可得到纯度大于

人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面表达（Ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术，获得人源中和性抗汉滩病毒汉滩型Ｇ１基因工程单克隆抗体（单抗）Ｆａｂ段基因及其表达，并同时获得抗汉滩病毒核蛋白（ＮＰ）的Ｆａｂ抗体。从肾综合征出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中，提取了总细胞ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，用一组人ＩｇＧＦａｂ基因特异性引物，从合成的ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增了一组轻链和重链Ｆａｂ段基因，将轻链和重链先后插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３，成功地建立了抗汉滩病毒抗体基因库，并用纯化的汉滩病毒颗粒及抗汉滩病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗体原的方法，对此抗体库进行了富集筛选，在短期内成功地获得了抗汉滩病毒核蛋白和糖蛋白Ｇ１的人源单抗Ｆａｂ段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人源ＩｇＧＦａｂ基因。用特异性放射免疫沉淀（ＩＰ）、ＩＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ以及空斑减少中和试验鉴定表明，表达的人Ｆａｂ抗体能识别汉滩病毒结构蛋白，其中抗Ｇ１人Ｆａｂ抗体具有体外中和活性。人源抗汉滩病毒基因工程抗体的获得，为今后可能的临床应用提供了良好前景。

从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆

曾从人源性噬菌体抗体库中筛选出１株抗人乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的Ｆａｂ克隆，为了筛选出新的抗ＨＢｓＡｇＦａｂ段，采用抗原屏蔽法，用已得到的Ｆａｂ段封闭相应的抗原决定基，对该抗体库进行了再次筛选，得到了１株新的人抗ＨＢｓＡｇＦａｂ段克隆，经序列分析发现其轻链可变区基因来源于Ｖκ１亚群和Ｊκ４基因，重链可变区基因来源于ＶＨ１亚群和ＪＨ４基因，但在ＶＨ第７７位和第７８位氨基酸残基之间出现了７个多余的氨基酸残基，经对基因数据库检索未能查到该序列的来源，但显然这段序列未影响抗体的抗原结合活性。

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg抗体片段并进行初步鉴定。方法收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库。以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定。结果构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性。经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3和hFabHB4。对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性。结论成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用。

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ_3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。

抗轮状病毒IgY和Fab’的分离与纯化

抗轮状病毒IgY可用两步盐析结合凝胶过滤从蛋黄中分离出来,用SDS-PAGE检测其纯度可达到95%以上。纯的IgY经胃蛋白酶分解得到的抗体片断(Fab),经SDS-PAGE和MALDI质谱法测定,其纯度达到99%以上。结果表明,所设计的分离抗轮状病毒IgY和Fab的方法简单、有效。经ELISA法检测,Fab的活性仍保持在IgY原始活性的70%以上。

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。

抗人精浆蛋白抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建编码抗人精浆蛋白抗体Fab基因的表达载体 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 :从克隆载体pUC19 К和pBluescriptKS(M13 ) Fd中 ,酶切获得抗人精浆蛋白单克隆抗体 (mAb)Fd基因和К链基因。然后将Fd和К链基因重组到Fab表达载体pComb3中 ,构建抗人精浆蛋白Fab基因的重组表达载体pComb3 Fab ,并在XL1 Blue菌中表达。结果 :经重组表达载体转化的XL1 Blue菌株可表达Fab基因。Westernblot和免疫细胞化学分析表明 ,表达产物Fab具有特异性结合精浆蛋白的活性。结论 :抗人精浆蛋白Fab基因成功地获得 ,为进一步将其与抗肿瘤药物偶联用于前列腺癌的导向治疗创造了条件。表达为构建其它基因工程抗体提供了基础。

超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建

目的构建超大容量非免疫人源性Fab抗体库。方法通过RT-PCR从208名不同人的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库。结果成功地构建了库容量为2.6×1012的人源性Fab段噬菌体抗体库。结论新的噬菌体抗体库对筛选不同抗原位点的抗体,提供有用的资源。

人抗HBsAg Fab段基因的序列分析及表达

本文对已建的噬菌体抗体库中分离的人抗HBsAg克隆进行了序列分析和表达研究,发现19个克隆都具有相同的重链可变区基因,轻链可变区基因有4个相同,其余15个未进行序列测定.DNA序列分析表明 V_H、J_H分属V_HⅢ和J_H6,D对段为二个D基因的融合,V_k,J_k属于V_kⅠ和J_k4.构建了可溶性Fab段表达载体,发现在细菌培养上清和质周腔中有类似的表达,其表达量约为5ug/ml,与HBsAg可特异性结合,经测定其亲和系数约为0.5×10~9M^(-1).

人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的 利用含重组质粒pBAD/HBsFab的Top10大肠杆菌 ,优化表达人源抗 HBsFab。方法 选取含pBAD/HBsFab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养 ,将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2 0 0 0发酵罐中 ,摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后 ,纯化蛋白 ,比较表达量 ,并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果 用摇瓶优化表达后 ,Fab蛋白占菌体总蛋白的 6 % ,为 0 .8mg/g菌体 ,利用发酵培养可进一步增加菌量 ,使蛋白表达量达 80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论 用重组质粒pBAD/HBsFab ,Top10表达系统 ,可得到 80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗 HBsFab蛋白 。

兔抗人ClqIgG（Fab＇）_2的制备及鉴定

本文利用硫酸铵盐析及ＤＥＡＥ纤维素层析提取兔抗人ＣｌｑＩｇＧ．经胃蛋白酶消化及ＳＰＡ－Ｓｅｐｌｉａｒｏｓｅ４Ｂ层析，制备了兔抗人ＣｌｑＩｇＧ（Ｆａｂ＇）＿２．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析分子量为９３ＫＤ；经Ｃｌｑ－ＥＬＩＳＡ滴定其效价为１０￣（－４）．与人ＩｇＧ无交叉反应；当该制剂预先经人Ｃｌｑ处理后，阻断其与Ｃｌｑ特异结合的能力，在合适的条件下可抑制Ｃｌｑ与Ｒａｊｉ细胞上ＣｌｑＲ的结合。表明用该法制备的兔抗人ＣｌｑＩｇＧ（Ｆａｂ＇）＿２具有较好的纯度及特异性，可用于ＣｌｑＲ功能的研究。

抗人IgGFc和Fab单克隆抗体的鉴定及应用

本文将采用木瓜蛋白酶水解和ＳＰＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱亲和层析等手段获得的人ＩｇＧＦｃ和Ｆａｂ，以抗人ＩｇＧＦｃ和抗人ＩｇＧＦａｂ单抗为参比品（Ｓｉｇｍａ）．鉴定了细胞库中抗人ＩｇＧ系列的部分细胞林，得到分泌特异性抗人ＩｇＧＦｅ和抗人ＩｇＧＦａｂ单抗的细胞各一株。在此基础上。应用抗人ＩｇＧＦｃ及抗人ＩｇＧＦａｂ单抗分别制备了Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱，纯化了酶解的人ＩｇＧＦｃ和Ｆａｂ。经ＥＬＩＳＡ法鉴定，相互间无交叉反应。同时用此方法还制备了人抗ＨＢｅＦａｂ，并将此Ｆａｂ标记过氧化物酶。配制ＨＢｅＥＬＩＳＡ诊断盒，证明其生物学活性未受影响，而且消除了类风湿因子引起的ＨＢｅＡｇ假阳性现象。

人源抗滋养层细胞表面抗原-2基因工程抗体Fab的制备及特性分析

应用噬菌体抗体库技术制备全人源抗滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)特异性Fab抗体片段.抗体库经细胞筛选和固相抗原筛选,获得特异性的阳性克隆.阳性载体经核酸序列分析后,构建工程菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,呈现28ku和32ku大小的两条蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与BxPc3细胞膜蛋白特异性结合,而与NIH3T3细胞不结合.免疫共沉淀与质谱分析结果表明,该Fab分子能够与Trop-2蛋白特异性结合.免疫组化显示,该抗体可结合胰腺癌细胞膜蛋白,在细胞培养液中加入Fab,能够抑制BxPc3细胞的生长.以上研究结果提示,该抗体有望成为胰腺癌临床影像诊断或治疗的候选分子.

人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗，我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α。方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５端引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ表达载体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入载体相应酶位点，片段与ＰＣＲ扩增片段大小相同，硷基序列正确。结论：ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ的成功构建。

抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达

目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导的定位点突变改造V_H氨基端序列;用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果:从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和k链基因,在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达,但活性很弱,将V_H氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后,明显改善了其活性,通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性。结论:获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体,并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性。

基因工程技术制备的人源性抗Mr48×10^3角蛋白抗体Fab片段的纯化与活性鉴定

目的 用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体Fab片段 ,并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定 .方法 将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白 Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达 ,产物经金属鏊合层析纯化 ,并用 EL ISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS- PAGE鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体 Fab片段识别的抗原组分 .结果 可溶性表达的抗角蛋白抗体 Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化 ,蛋白印迹明确纯化产物为人 Fab片段 .所纯化的 Fab片段在非还原 SDS-PAGE中形成 Mr5 0× 10 3单一条带 ,在还原 SDS- PAGE中可见 Mr 2 3× 10 3,Mr 2 5× 10 3两条带 .EL ISA和 Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性 .结论 成功表达并鉴定了人源性抗 Mr 4 8× 10 3角蛋白的 Fab可溶性片段 ,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础 .

大肠杆菌发酵生产重组人源抗-HBs Fab

在KLF2 0 0 0发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD HBsFab的TOP10大肠杆菌 ,生产人源抗 HBsFab ,为批量生产作准备。在发酵过程中 ,控制溶氧 30 %以上 ,温度 37℃ ,在基础培养基内生长 4h后 ,补加以甘油为碳源的补料 ,继续生长到 9h ,加入阿拉伯糖 ,至终浓度为 0 0 2 % ,30℃诱导表达 5h ,收集菌体 ,纯化制备目的蛋白。利用Westernblot方法检测Fab抗原性 ,Dotblot方法检测生物学活性。 14h发酵结束后 ,菌体密度最终达 96g L ,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的 6 % ,含量为 80mg L。以重组质粒pBAD HBsFab ,大肠杆菌TOP10表达生产的人源抗 HBsFab为可溶性具生物学活性的蛋白 ,与包涵体表达相比避免了变性、复性这一复杂过程 ,发酵罐表达比率与摇瓶相比没有降低 ,表达量达 80mg L左右 ,为大批量生产作了准备。