MT01对Pg感染的成骨细胞MG63特异性成骨相关因子表达的影响

目的:通过检测MT01对牙周致病菌Pg感染的成骨细胞MG63细胞内特异性成骨相关因子基因表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨分化作用的影响。方法:选取生长状态稳定的人成骨样细胞MG63接种于6孔板,分别加入质量浓度1mg/L的特定序列寡核苷酸MT01和等体积PBS,共孵育3h后,加入感染复数MOI=100∶1的Pg菌悬液(对照组加等体积PBS)。即实验分为:MT01+Pg、MT01、Pg和空白对照4组,Realtime PCR检测2、4、6、8、12、24h特异性成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达。结果:在有无Pg感染的状态下,MT01均可上调成骨细胞MG63细胞内成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达,但在不同时间点,MT01调控Runx2,SP7mRNA表达上调的能力存在差异。结论:MT01可以促进牙周致病菌感染下的成骨细胞的成骨向分化。

利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG63 OPG及TNFα表达的影响

目的研究利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG63护骨素(OPG)及肿瘤坏死因子α(TNFα)表达的影响,以阐明利塞膦酸钠发挥骨保护作用的机制。方法以不同浓度(10-10molL;10-9molL;10-8molL;10-7molL)的利塞膦酸钠干预MG63细胞72h;ELISA法测定细胞条件培养液中OPG及TNFα的含量。结果利塞膦酸钠可下调MG63细胞TNFα的表达;上调OPG的表达;并提高碱性磷酸酶(ALP)活性。结论利塞膦酸钠可通过调节成骨样细胞MG63OPG、TNFα的表达,从而发挥其抗骨吸收的作用。

富血小板血浆对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响

目的研究富血小板血浆(PRP)对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响,探讨PRP的生物学功能。方法采集健康志愿者的静脉血,两次离心法制备PRP,氯化钙加人凝血酶激活后离心提取PRP萃取液。碱性磷酸酶(ALP)染色检测不同体积分数PRP(0、1%、2%、3%)对MG63分化活性的影响,碘化丙啶(PI)荧光染色观察PRP作用下MG63细胞形态的变化,免疫细胞化学检测PRP对MG63表达转化生长因子-β(TGF-β)的影响,扫描电子显微镜(SEM)观察PRP对MG63在人工骨材料表面生长情况的影响,CCK-8法检测PRP对MG63增殖活性的影响,流式细胞术(FCM)检测经PRP培养后不同时间MG63的细胞周期,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PRP作用下MG63中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)mRNA的表达量。结果 ALP检测见3%PRP组ALP阳性细胞染色最深,并随体积分数的增加染色强度增加,且PRP组细胞均出现不同程度的脱片现象。PI荧光染色见PRP组细胞核荧光染色较对照组增强。免疫细胞化学检测见3%PRP组TGF-β表达量最高(P<0.05)。SEM观察:PRP组材料表面MG63密集,生长状态良好。CCK-8法测定细胞增殖活性,显示4.8%PRP组吸光度A450 nm值高于对照组(P<0.05)。FCM检测表明:PRP组第2天S期细胞百分比高于对照组(P<0.05);第10天PRP组G0/G1期细胞百分比高于对照组(P<0.05);除第6天外,PRP组G2/M期细胞百分比均高于对照组。RT-PCR结果表明:PRP组MG63的Col-ⅠmRNA表达量较对照组明显上调。结论适宜体积分数的PRP对MG63的增殖、迁移和相关蛋白、基因的表达有促进作用,PRP具有统一、协调细胞生物学行为的作用。

不同浓度葡萄糖对人成骨肉瘤细胞株MG63活性的影响

目的观察不同浓度葡萄糖对体外培养的人成骨肉瘤细胞株MG63的影响,探讨糖尿病导致骨质疏松症可能的发病机制。方法采用4种不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L),培养基连续培养人成骨肉瘤细胞株MG63,观察葡萄糖对细胞增殖、分泌活性产物的能力、凋亡以及矿化能力等各个方面的影响。结果升高的葡萄糖浓度对细胞的增殖具有一定的促进作用,但增多的细胞数量并没有带来相应细胞活性的增加。相反,细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的能力以及矿化能力不同程度的出现了下降,且在不考虑渗透压因素情况下,细胞凋亡比率增加。结论本实验证实了高糖环境对细胞活性,特别是矿化能力的抑制作用,为临床工作中严格控制血糖防止骨质疏松症的发生提供了理论依据。

氧化应激对人成骨样细胞MG63活性的影响

目的建立人成骨样细胞氧化应激模型,研究氧化应激对人成骨样细胞形态和增殖活力的影响。方法用不同浓度黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase,X/XO)的酶促反应产生的超氧阴离子自由基(O_2^-˙)刺激人成骨样细胞MG63,建立成骨细胞内氧化应激模型,用X/XO加黄嘌呤氧化酶抑制剂羟嘌呤醇研究其对该氧化应激模型的逆转作用。运用氧化敏感性荧光探针2'7'-二氯荧光黄双乙酸盐结合流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,用倒置相差显微镜和MTT实验观察研究氧化应激对成骨细胞形态及增殖活力的影响。结果 X/XO处理MG63细胞后,细胞形态发生明显破坏;在相同处理时间下,X/XO浓度越高,细胞内ROS荧光强度值越高,吸光光密度(opitical density,OD)值越低,差异具有统计学意义(P<0.05),且X/XO加羟嘌呤醇联合处理组的细胞内ROS平均荧光强度较相同浓度X/XO单独处理组明显降低(P<0.05)。在相同X/XO处理浓度下,随着处理时间的延长,细胞内ROS平均荧光强度逐渐增强,OD值明显降低,120 min时细胞内ROS平均荧光强度比对照组增加了345%。24 h时OD值为相同时间对照组的22.9%。结论 X/XO可导致人成骨样细胞氧化应激损伤,破坏人成骨样细胞的形态,抑制人成骨样细胞的增殖活力。X/XO抑制剂羟嘌呤醇可逆转X/XO引起的人成骨样细胞氧化损伤。

BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡及其作用机制

目的研究BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡的影响及其可能的机制。方法以0、2、4、6、8、10μmol/L BMS-345541处理MG63细胞24、48 h后,用CCK-8法检测细胞存活率。用0、2、4、8μmol/L药物作用细胞24 h后,以PI染色法观察细胞凋亡情况、流式细胞仪检测细胞凋亡。以同样浓度作用细胞48 h,Western-blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果 (4-10)μmol/L的BMS-345541均可抑制MG63细胞的增殖,其抑制效应呈剂量-时间依赖性,48 h最低存活率只有(0.412±0.024)(P<0.05)。PI染色荧光显微镜观察结果发现:随药物浓度增高,相同视野下正常细胞数逐渐降低,凋亡细胞数逐渐增高。流式细胞仪分析:0、2、4、8μmol/L的作用BMS-345541 24 h后,凋亡率分别为(5.2±0.78)%、(5.82±0.82)%、(8.86±1.71)%、(11.01±2.69)%,与对照组相比,8μmol/L组差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示MG 63细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达量上调,与对照组相比,2、4、8μmol/L组差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMS-345541可抑制MG63细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其作用机制可能与cleaved caspase-3表达上调有关。

MT01/PEN复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白和核因子κB受体活化因子配体的影响

目的应用聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEN)载体装载寡脱氧核苷酸MT01,制备MT01/PEN复合物,检测该复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的影响。方法制备3种不同配比的MT01/PEN(质量比分别为1∶2、1∶4、1∶6)复合物,以全硫代化修饰MT01(MT01-s)和未修饰的MT01作阳性对照,分别转染MG63细胞。采用酶联免疫吸附测定法和real-time聚合酶链反应法分别检测培养24、48、72 h时各组上清液及细胞内OPG和RANKL的表达水平。结果经MT01/PEN复合物转染后,上清液及细胞内OPG表达水平均升高(P<0.05);多数组中RANKL表达水平降低,而OPG/RANKL比值呈升高趋势(P<0.05);不同质量配比的MT01/PEN均对MG63细胞的成骨具有影响,其中质量比为1∶6时作用最明显。结论应用PEN作为基因载体装载MT01可增强MT01对MG63细胞的促成骨作用。

虫草素对人骨肉瘤细胞株MG63增殖及凋亡的影响

目的研究不同浓度虫草素对人骨肉瘤细胞株MG63增殖与凋亡的影响。方法不同浓度虫草素作用于MG63细胞48 h后,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTS法检测虫草素对MG63细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测虫草素对MG63细胞周期和凋亡的作用,Hoechst 33342染色和Western blot检测虫草素对骨肉瘤细胞凋亡的影响。结果虫草素对人骨肉瘤细胞增殖有显著抑制作用,且呈浓度和时间依赖性。流式细胞术结果显示该细胞被阻滞在S期和G_2/M期(P<0.05),同时虫草素可引起MG63细胞早期凋亡(P<0.05)。Western blot结果显示,随虫草素浓度增加,Bcl-2蛋白表达下调,而Bax蛋白表达上调,且各实验组均出现蛋白分子量为89 k D的PARP裂解条带。结论虫草素通过下调MG63细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2并上调促凋亡蛋白Bax表达,同时阻滞细胞周期进展,促进早期凋亡。

MT01对感染状态人成骨样细胞内ALP活性及mRNA表达的影响

目的:通过检测MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的人成骨样细胞内特异性成骨相关因子ALP活性及mRNA表达水平的改变,探讨MT01对感染状态下人成骨样细胞成骨向分化的影响。方法:选取状态良好的MG63细胞接种于6孔板内,2个MT01组加入质量浓度为1mg/L的MT01,共孵育3h后,相应组加入感染复数为100∶1的Pg菌悬液。实验分为:空白对照、MT01、Pg和MT01+Pg4组,碱性磷酸酶测试盒测定24h后上清液及细胞内ALP活性。Real-time PCR检测2、4、6、8、12、24h特异性成骨相关因子ALP mRNA的表达。结果:在感染与非感染情况下,MT01均可促进ALP活性,且上调MG63细胞内成骨相关因子ALP mRNA表达,其表达上调呈时间依赖性。结论:MT01可促进感染及非感染状态下MG63内ALP基因表达水平,提高ALP活力。

石见穿多糖通过Wnt/β-catenin信号通路调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

目的探讨石见穿多糖通过Wnt/β-catenin信号通路调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。方法不同浓度石见穿多糖(0、0.25、0.5、1 mg/mL)处理人OS MG63细胞24 h,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,RT-PCR检测人OS细胞β-catenin mRNA表达,Western blot检测人OS MG63细胞Vimentin、E-cadherin蛋白表达。结果石见穿多糖抑制细胞迁移、侵袭(P<0.01),降低β-catenin mRNA及Vimentin蛋白表达(P<0.05,P<0.01),促进E-cadherin蛋白表达(P<0.01),且上述作用呈现剂量依赖性。结论石见穿多糖能抑制人OS MG63细胞的迁移和侵袭能力,这种作用可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而阻断EMT过程而引起的。

空间贴壁细胞培养模块研制及特性测试

针对空间环境的特殊性以及空间站资源有限性,研制一种空间细胞培养模块,使其适合在空间飞行或空间站进行细胞培养。根据空间搭载标准架构接口要求和细胞培养要求,提出模块的设计方案,包括培养室及密封设计;然后对模块的材料进行生物相容性筛选,并利用此模块培养骨肉瘤细胞(MG63),从骨肉瘤细胞的活力和凋亡两方面评价其培养效果。实验结果表明,研制的空间细胞培养模块操作简单,密封效果好,生物相容性佳。利用此模块培养MG63细胞72 h后,细胞生长状态和铺展性良好,细胞活性和凋亡与传统细胞培养瓶相比无显著性差异。可应用于空间飞行和空间站的细胞培养。

Inhibition of Cell Growth and Telomerase Activity in Osteosarcoma Cells by DN-hTERT

In order to study the effects of dominant negative human telomerase reverse transcriptase （DN-hTERT） on cell growth and telomerase activity in osteosarcoma cell line MG63, MG63 cells were transfected with DN-hTERT-IRES2-EGFP9 （DN） or IRES2-EGF （I, blank vector） with lipofectamine 2000. The stably transfected cells were selected with G-418. Cell growth properties were examined under a fluorescence microscope. The hTERT mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Telomerase activities were measured by TRAP-ELISE. The tumorigenicity was studied with tumor xenografts by subcutaneous injection of cancer cells into nude mice. The results showed that cell growth was suppressed in MG63 cells transfected with DN-hTERT. The hTERT mRNA was increased in N-hTERT transfected-MG63 cells （MG63/DN）. The telomerase activity was 2.45±0.11 in MG63/DN cells, while 3.40±0.12 in the cells transfected with blank vector （MG63/I）, （P〈0.05）; DN-hTERT-expressing clones did not form tumors in 2 weeks, but the ratio of tumorigenesis was 30 % in nude mice bearing MG63/I （P〈0.01）. It was concluded that DN-hTERT could specifically inhibit the cell growth and telomerase activity in MG63 cells.

M007介导的光动力疗法对人成骨肉瘤MG63细胞增殖的影响

目的观察新型光敏剂M007介导的光动力疗法(PDT)对体外培养人成骨肉瘤MG63细胞增殖能力的影响。方法取1mL含人成骨肉瘤MG63细胞1×106/mL的单细胞悬液加至培养皿中,分为实验组(M007-PDT组)、空白对照组(B组)、光照对照组(L组)和光敏剂对照组(M007组),按分组加入不同浓度M007(0,2,4,8,16μmol/L),分别用多光源红光光照系统或暗反应处理10min。采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色的流式细胞分析法,检测各组的细胞残存率及死亡方式;四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验和细胞集落形成实验评估不同组残存细胞的增殖能力。实验组和对照组同步进行,每组重复6次。结果 M007浓度为2～16μmol/L时,其介导的光动力疗法能使超过90%的MG63细胞以晚期凋亡/坏死,或成为裸核的方式被灭活,在4～16μmol/L时,维持残存率小于1%;2～8μmol/L M007-PDT组中的残存细胞生长曲线低平,其光吸收值未随培养时间延长而增加(P>0.05),并且不能形成细胞集落,但2μmol/L M007-PDT组偶见一次16个活细胞。结论 M007浓度大于4μmol/L后,其介导的光动力疗法能完全灭活人成骨肉瘤MG63细胞,该技术应用于肿瘤术野血液回收有着良好的前景。

β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化

目的:观察分析β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化。方法:培养MG63细胞株,用不同浓度的Wnt3a蛋白或相同浓度、不同时间段的Wnt3a蛋白刺激液MG63细胞生长,用FQ-PCR在m RNA水平检测β-catenin在MG63细胞系的表达变化。培养MG63细胞株,用相同浓度的Wnt3a蛋白刺激,比较刺激组与空白对照组的细胞数目的差别。结果:在细胞生长的第0,1天两组的MG63细胞数量对比没有统计学差异(P>0.05);而在第2,3,4天对照组细胞增殖速度较刺激组缓缓,经比较(t=4.109,3.892,5.215,均P<0.05)。β-catenin基因表达不会因为Wnt3a的浓度增加而增加。100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表达最高,其他几个浓度的β-catenin基因表达对比没有统计学差异(P>0.05)。在100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激下,β-catenin基因表达会随时间延长而增加,6 h时β-catenin基因表达最高(P<0.05),随后β-catenin基因表达则没有统计学差异(P>0.005)。结论:Wnt蛋白对MG63细胞有正向增加增殖作用。激活Wnt/β-catenin信号通路能促进MG63的细胞增殖。

汉防己碱对成骨肉瘤MG63细胞生长的作用

采用体外细胞培养,结合流式细胞术和M T T方法研究汉防己碱对M G63细胞生长的作用特点。汉防己碱(0.33Lg/mL)对M G 63细胞仅有轻度抑制作用,细胞存活率保持在88%—97%。汉防己碱浓度依赖性轻度降低cDDP对MG63细胞的IC50;低浓度T et(0.33Lg/mL)明显提升cDD P对M G63/cDDP细胞I C50,但0.5和1.0Lg/mL显著降低cD DP对M G 63/cDDP细胞的I C50。汉防己碱对M G 63/cDDP细胞则既可增加细胞耐药发展(0.33Lg/mL),也可逆转肿瘤细胞对cDDP的耐药性(1.0Lg/mL)。

黄芩苷对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及MMPs表达的影响

目的:研究黄芩苷对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。方法:以0(空白对照)、5、10、20、40、80、160、320μg/ml黄芩苷处理MG63细胞24 h后,检测细胞存活率和细胞中MMP-2、MMP-9的表达量,计算半数抑制浓度(IC50),观察细胞凋亡情况。结果:与空白对照比较,黄芩苷处理MG63细胞后细胞存活率降低,凋亡细胞数量增加,细胞中MMP-2和MMP-9表达量降低,并以320μg/ml黄芩苷处理时细胞中MMP-2和MMP-9表达量下降具有统计学意义(P<0.05);IC50为(40.21±9.20)μg/ml,各作用效应均呈浓度依赖性。结论:黄芩苷可抑制MG63细胞增殖,诱导其凋亡,较高质量浓度时可抑制细胞中MMP-2、MMP-9的表达。

阿仑膦酸钠对人成骨细胞株MG63活性功能的影响

本文研究了阿仑膦酸钠(Alen)对成骨细胞活性功能的影响,为其临床应用提供细胞学实验支持。采用体外细胞培养的方法观察不同浓度Alen对人成骨细胞株MG63细胞增殖、细胞形态、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原以及钙沉积效应的影响。结果表明:较低浓度(1×10-9 mol/L和1×10-7 mol/L)时,Alen对MG63细胞增殖、细胞形态、ALP表达和Ⅰ型胶原合成无明显影响;在高浓度(1×10-5 mol/L)时,MG63细胞的增殖活性受到抑制,电镜观察可见细胞凋亡;浓度为1×10-9 mol/L时,Alen能促进MG63细胞的钙沉积,而浓度为10-5 mol/L时可抑制MG63细胞的钙沉积。本研究提示低浓度Alen能在一定程度上促进人成骨细胞的矿化能力,有利于骨形成。

核因子-κB介导肿瘤相关巨噬细胞对骨肉瘤增长的影响及其作用机制的实验研究

目的探讨核因子-κB(NF-κB)介导肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对骨肉瘤增长的影响及其作用机制。方法选取4~6周无特定病原体级Balb/c雄性裸鼠15只,数字表法随机分为人骨肉瘤MG63细胞组、人单核巨噬细胞系THP-1细胞组、MG63+THP-1混合细胞组3组,每组5只。于裸鼠右侧腋窝皮下注射浓度为1.0×10^8/mL的不同细胞悬液制备裸鼠成瘤模型:MG63细胞组裸鼠每只注射MG63细胞悬液0.2 mL,THP-1细胞组裸鼠每只注射THP-1细胞悬液0.2 mL,MG63+THP-1混合细胞组裸鼠每只注射MG63+THP-1混合细胞悬液(9∶1)0.2 mL。注射细胞后每天观察各组裸鼠是否出现移植瘤,从MG63组和MG63+THP-1混合细胞组均出现移植瘤当天开始,用游标卡尺测量移植瘤的长径和短径,并计算移植瘤体积,此后每5天测量1次,对比不同时间各组移植瘤生长情况;注射细胞后第25天处死裸鼠,剥离移植瘤,对比各组移植瘤质量。将移植瘤置于10%甲醛中固定,制备石蜡切片,采用HE染色,观察各组移植瘤的肿瘤特征改变;采用免疫组织化学SP染色,观察各组移植瘤中核转录因子NF-κB蛋白的表达情况;采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件定量分析比较各组移植瘤中NF-κB蛋白的表达水平。结果THP-1细胞组裸鼠没有形成移植瘤。MG63+THP-1混合细胞组和MG63细胞组的裸鼠分别从注射细胞后第7天、第10天开始腋窝皮下可触及移植瘤,且随时间增加,肿瘤体积逐渐增大;第10、15、20和25天MG63+THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤体积分别为(474.4±56.1)、(945.0±79.7)、(2 886.0±462.3)、(3 319.6±388.4)mm^3,均明显大于MG63细胞组的移植瘤体积(233.3±28.2)、(669.6±75.9)、(1 464.0±135.2)、(2 068.0±223.2)mm^3,差异均有统计学意义(t=3.536、2.504、2.952、2.794,P值均<0.05)。在种植细胞后第25天处死裸鼠,MG63+THP-1混合细胞组移植瘤质量(0.920±0.134)g,明显大于MG63细胞组(0.544±0.079)g,差异有统计学意义(t=2.404,P<0.05)。移植瘤HE染色显示,MG63细胞组和MG63+THP-1混合细胞组移植瘤均可见明显的肿瘤特征改变。免疫组织化学SP染色显示,NF-κB蛋白在MG63细胞组和MG63+THP-1混合细胞组移植瘤组织和组织间隙均呈高表达状态;检测NF-κB蛋白表达水平,MG63+THP-1混合细胞组NF-κB蛋白吸光度值(0.362±0.006),明显大于MG63细胞组NF-κB蛋白吸光度值(0.326±0.006),差异有统计学意义(t=9.895,P<0.05)。结论TAMs可以促进骨肉瘤的增长,其作用机制可能与NF-κB蛋白高表达有关。