多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-1、MMP-3表达的影响

目的探讨多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素(IL)-1α对人角膜基质细胞MMP-1、-3表达的影响。方法体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL-1α,培养5 d,通过免疫印迹分析法测定培养上清中的MMP-1、-3的表达。结果在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP-1、-3;添加IL-1α后可诱导前体MMP-1、-3表达,而添加多核白细胞弹性蛋白酶不能诱导MMP-1、-3的表达;多核白细胞弹性蛋白酶可激活在IL-1α诱导下产生的前体MMP-1、-3转化为活化形式的MMP-1、-3。结论多核白细胞弹性蛋白酶和IL-1α可协同诱导角膜基质细胞的胶原降解,诱发角膜溃疡的发生。

白细胞介素-1β通过P38MAPK信号通路调节人牙周膜成纤维细胞MMP-1表达的研究

目的:探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)信号通路在白细胞介素-1β(IL-1β)调节人牙周膜成纤维细胞中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达中的作用。方法:体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs),随机将其分为:①对照组:加入等量无血清培养液;②实验组1:加入10 ng/mL IL-1β作用24 h;③实验组2:加入10μmol/L SB203580预处理30 min后,再加入10 ng/mL IL-1β作用24 h,然后分别采用噻唑蓝比色测定法(MTT)检测各组hPDLFs的增殖情况;Real-time PCR、免疫荧光技术及Western blot观察MMP-1各组mRNA和蛋白表达的变化。结果:各组MMP-1mRNA和蛋白的表达均以IL-1β作用组最高,IL-1β联合SB203580复合作用组次之,对照组最低,3组间两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-1β可通过激活p38MAPK途径促进人牙周膜成纤维细胞MMP-1的表达。

茶多酚对脂多糖介导下人牙周膜成纤维细胞MMP-1、MMP-2表达的影响

目的:观察茶多酚(TP)在脂多糖(LPS)介导下对人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)MMP-1、MMP-2表达的影响。方法:体外培养HPDLCs,在培养液中添加TP(200μg/ml)作用于脂多糖(100μg/ml)介导的HPDLCs,培养24、48、72 h,ELISA法检测HPDLCs分泌MMP-1和MMP-2的量。荧光实时定量PCR法检测HPDLCs中MMP-1和MMP-2 mRNA的表达。结果:在LPS介导下HPDLCs MMP-1和MMP-2分泌量和基因表达升高,TP可抑制LPS介导下HPDLCs MMP-1和MMP-2表达。结论:TP可抑制LPS介导的人牙周膜细胞的胶原降解。

Celecoxib抑制人黑素瘤A375细胞增殖及对Cox-2/MMP-1蛋白表达的影响

目的研究Celecoxib(塞来考昔)对人黑素瘤A375细胞增殖抑制、凋亡诱导和周期阻滞作用及对A375细胞表达Cox-2和分泌型MMP-1蛋白的影响。方法MTT法测定Celecoxib对A375细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡及周期阻滞作用;细胞爬片SABC免疫细胞化学检测Celecoxib对A375细胞Cox-2蛋白表达的影响,ELISA法分析Celecoxib对A375细胞分泌型MMP-1蛋白表达的影响。结果80μmol/L的Celecoxib明显抑制人黑素瘤A375细胞增殖,并诱导凋亡(凋亡率35.91%)和G2/M期阻滞,减少A375细胞表达Cox-2蛋白和分泌型MMP-1蛋白。结论人黑素瘤A375细胞表达Cox-2蛋白和MMP-1蛋白,Celecoxib是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。

基质金属蛋白酶-1在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在人涎腺腺样囊性癌不同转移力细胞系中的表达。方法:以人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞系及其高转移株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型,采用免疫组化法和蛋白印迹(Western blot)法检测MMP-1的蛋白表达水平。结果:MMP-1在ACC-M细胞中的表达水平高于ACC-2细胞。结论:MMP-1在人涎腺腺样囊性癌的侵袭转移过程中可能发挥作用。

人源性基质金属蛋白酶-1原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人源性基质金属蛋白酶 -1(MMP -1)原核表达载体。 方法 从人肝组织提取总RNA ,以此为模板 ,逆转录巢式PCR扩增MMP -1全编码区基因片段 ,构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体 pMAL -C2x重组质粒亚克隆 ,经双酶切及核苷酸测序进行分析鉴定。 结果 成功地构建了人MMP -1原核表达载体。 结论 构建的人MMP -1原核表达载体 ,为以后MMP -1融合蛋白的表达并获得具有抗原性的MMP -1融合蛋白奠定了基础。

糖耐康对转化生长因子-β_1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化细胞因子的影响

目的观察糖耐康药物血清干预转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)纤维化细胞因子的作用,探讨糖耐康防治肾纤维化的作用机理。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养。实验分为空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL+5%糖耐康药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL+10%糖耐康药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL+20%糖耐康药物血清)。药物干预24 h后,荧光定量PCR检测结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA的表达。结果 HK-2细胞经TGF-β1诱导后,CTGF、PAI-1 mRNA的表达显著上升,而MMP-9 mRNA的表达减弱,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经糖耐康药物血清干预后,CTGF、PAI-1 mRNA的表达逐步下降,而MMP-9 mRNA的表达逐步上升,与单纯TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论糖耐康在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞纤维化,其机制可能与调节纤维化细胞因子表达有关。

人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP 1的OD值。结果 :获得初步纯化的兔抗人MMP 1特异性多克隆抗体 ,该抗体能与人MMP 1起反应。结论:制备的MMP

神经鞘氨醇磷酸胆碱对人真皮成纤维细胞表达MMP-1,MMP-3和TIMP-1的影响

目的研究神经鞘氨醇磷酸胆碱(shingosylphosphorylcholine,SPC)对体外培养人真皮成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶内源性组织抑制剂-1(TIMP-1)的影响,探索在促进皮肤创伤愈合方面SPC的作用机制。方法通过MTT的方法检测SPC在成纤维细胞增殖效率方面的作用。利用RT-PCR和Western blotting的方法检测体外培养人真皮成纤维细胞经5μmol/L SPC诱导后,表达损伤修复相关蛋白MMP-1,MMP-3,TIMP-1的情况。结果一定浓度的SPC具有促进成纤维细胞增殖的作用。5μmol/L SPC具有上调成纤维细胞表达MMP-1,MMP-3,TIMP-1 m RNA和蛋白的作用(P<0.05)。结论实验证实体外培养人真皮成纤维细胞在经SPC干预后,其表达细胞外基质调节蛋白MMP-1,MMP-3,TIMP-1的作用得到增强,提示SPC具有促进皮肤创伤愈合的作用。

人巨细胞病毒感染致颈动脉粥样硬化机制的探讨

目的比较颈动脉粥样硬化斑块与正常颈动脉中的人巨细胞病毒核酸(HCMV DNA)、血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达情况,探讨人巨细胞病毒感染与颈动脉粥样硬化的关系。方法收集31例行颈动脉内膜剥脱术后的颈动脉粥样硬化斑块标本作为动脉粥样硬化组,所有标本均于手术后12 h内取材。另选择性别、年龄与动脉粥样硬化组相匹配的28例正常颅内动脉标本作为对照组,均于死亡后12 h内行尸体解剖并取材。应用原位杂交技术检测2组标本中HCMV DNA表达情况,利用免疫组化法检测LOX-1、MMP-2、MMP-9表达情况;统计颈动脉粥样硬化组伴及不伴危险因素者HCMV DNA阳性细胞计数,HCMV DNA阳性与阴性表达者、血脂水平正常与异常者LOX-1、MMP-2、MMP-9阳性细胞计数。结果动脉粥样硬化组HCMV DNA、LOX-1、MMP-2、MMP-9阳性表达率及LOX-1、MMP-2、MMP-9阳性染色面积中位数和OD值中位数均明显高于对照组(P均<0.05)。颈动脉粥样硬化组中高TG血症、血清LDL水平>2.60 mmol/L和既往吸烟者HCMV DNA阳性细胞计数高于相应不伴危险因素者(P均<0.05)。动脉粥样硬化组中HCMV阳性者LOX-1阳性细胞计数明显高于HCMV阴性者(P均<0.05),而HCMV阳性者与HCMV阴性者MMP-2、MMP-9阳性细胞计数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。TG正常与升高者LOX-1、MMP-2和MMP-9阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);LDL>2.6 mmol/L者LOX-1阳性细胞数明显高于LDL正常者(P<0.05)。结论HCMV感染是动脉粥样硬化危险因素之一,LOX-1、MMP-2及MMP-9参与颈动脉粥样硬化的病理过程,HCMV感染可能通过上调LOX-1基因表达从而促进动脉粥样硬化的发生、发展。

姜黄素抗血管生成分子机制的探讨

目的:研究姜黄素抑制血管生成的分子机制。方法:采用MTT法、流式细胞术(FCM)观察姜黄素对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的抑制作用及促凋亡作用。采用RT-PCR法及Western-blot法检测姜黄素作用人肺腺癌A2细胞不同时间后血管生成素(Ang-1、Ang-2)、血小板反应素(TSP)mRNA的表达水平和血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP-9)的蛋白表达水平。结果:姜黄素能抑制HUVECs的增殖,呈时间及浓度依赖性,且能诱导HUVECs凋亡,凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。A2细胞经100μmol/L姜黄素作用不同时间后Ang-1、Ang-2、TSPmRNA的表达率明显下降;VEGF与MMP-9的蛋白表达也明显减少。结论:姜黄素可能通过下列途径抑制肿瘤的血管生成:1)直接抑制血管内皮细胞增殖并促进其凋亡;2)抑制血管生成促进因子(VEGF,Ang-1,Ang-2)的表达;3)促进血管生成抑制因子TSP的表达;4)降低基质金属蛋白酶MMP-9的活性从而抑制细胞外基质降解。

Src酪氨酸激酶在人胃癌细胞转移中的作用和机制

背景与目的:Src酪氨酸激酶的活化在胃癌浸润和转移中发挥了重要的作用。本研究旨在探讨Src酪氨酸激酶对人胃癌细胞E-钙黏着蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、9表达、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌、转录因子NF-κB和AP-1表达以及胃癌细胞体外侵袭能力的影响。方法:使用Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉(3和10μmol/L)后,应用Western blot法检测人胃癌SGC7901细胞中E-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表达变化;应用实时PCR(real-time PCR)检测细胞中E-cadherin、MMP-2和MMP-9的mRNA表达变化;应用ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF表达变化;应用双荧光报告基因法检测NF-κB和AP-1转录活性;应用Transwell法检测肿瘤细胞侵袭能力变化。结果:当Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉浓度为3和10μmol/L时,SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达量显著增加,E-cadherin的mRNA表达是对照组的263.8%(P<0.05)和403.3%(P<0.05);MMP-2和MMP-9的蛋白表达显著降低,MMP-2的mRNA表达是对照组的28.3%(P<0.05)和16.7%(P<0.05),MMP-9的mRNA表达是对照组的23.6%(P<0.05)和13.3%(P<0.05);VEGF含量是对照组的62.6%(P<0.05)和38.7%(P<0.05);AP-1转录活性是对照组的54.4%(P<0.05)和18%(P<0.05),NF-κB转录活性是对照组的38.3%(P<0.05)和11.5%(P<0.05);胃癌细胞侵袭能力是对照组的43.3%(P<0.05)和28.2%(P<0.05),呈现明显的剂量依赖性抑制作用。结论:Src酪氨酸激酶活化与人胃癌SGC7901细胞体外转移能力密切相关,其机制可能与肿瘤转移相关基因表达有关。

人基质金属蛋白酶-1的基因克隆、表达及其产物抗原性的分析

目的 构建人基质金属蛋白酶 1(MMP 1)基因重组质粒的克隆 ,获得具有抗原性的人MMP 1融合蛋白。方法 从人肝组织提取总RNA ,以此为模板 ,逆转录巢式PCR扩增MMP 1全编码区基因片段 ,构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体 pMAL c2x重组质粒亚克隆 ,经异丙基 β D半乳糖苷酶 (IPTG)诱导表达MMP 1重组质粒菌 ,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western blot对重组蛋白进行分析鉴定。结果 经核苷酸序列测定和免疫印迹鉴定 ,成功地构建了人MMP 1重组质粒基因工程菌 ,并表达具有MMP 1抗原性的融合蛋白。结论 构建了人MMP 1重组质粒克隆 ,获得了具有抗原性的MMP 1融合蛋白 ,这将有助于今后制备MMP 1多克隆抗体。

镰形棘豆总黄酮对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化因子的影响

目的:研究镰形棘豆总黄酮防治肾间质纤维化作用及其机制。方法:大鼠按300 mg.kg-1ig镰形棘豆总黄酮,连续给药3 d后制备含药血清,空白组大鼠ig同体积生理盐水制备空白血清。将人肾小管上皮细胞(HK-2)用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养,分为4组:空白对照组、单纯转化生长因子-β1(TGF-β110μg.L-1)诱导组、空白血清对照组(TGF-β110μg.L-1+10%空白血清)、干预组(TGF-β110μg.L-1+10%镰形棘豆总黄酮含药血清)。药物干预24 h后,荧光定量PCR检测结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA的表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,CTGF,PAI-1 mRNA的表达显著上升,而MMP-9 mRNA的表达减弱,与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05),经镰形棘豆总黄酮药物血清干预后,CTGF、PAI-1 mRNA的表达逐步下降,而MMP-9 mRNA的表达逐步上升,与单纯TGF-β1诱导组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:镰形棘豆总黄酮在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化,其机制可能与调节纤维化细胞因子CTGF,PAI-1和MMP-9的mRNA表达有关。

复方鳖甲软肝片减方对CCl_4诱导大鼠肝纤维化的影响及机制研究

目的探讨复方鳖甲软肝片(CBRP)减去处方中紫河车后(即复方鳖甲软肝片减方,MF-CBRP)对肝纤维化大鼠的保护作用及其机制。方法将SD大鼠随机分为对照组,模型组,阳性对照组(秋水仙碱,0.1 mg/kg),CBRP组(0.594 7g/kg)和MF-CBRP高、低剂量(1.061 0、0.530 5 g/kg)组。除对照组外,其余各组大鼠sc CCl_4大豆油溶液制备大鼠肝纤维化模型,连续6周。造模结束后,各给药组ig对应剂量的药物治疗6周。给药结束后,检测大鼠血清生化指标、脂质过氧化指标以及纤维化因子、羟脯氨酸(Hyp)、血小板衍生因子-α(PDGF-α)和结缔组织生长因子(CTGF)量的变化;观察肝组织HE染色和Masson染色的变化;应用免疫组化和RT-PCR法检测大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)m RNA表达水平。结果与模型组比较,MF-CBRP可以使大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(T-Bil)和碱性磷酸酶(ALP)水平降低(P<0.01),AST/ALT、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平显著增高(P<0.05、0.01),使超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)量升高(P<0.05)、丙二醛(MDA)量降低(P<0.01),抑制肝组织中Hyp、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)和IV型胶原(IV-C)的表达(P<0.05、0.01),使肝组织中PDGF-α和CTGF量降低(P<0.01),抑制MMP-2和TIMP-1 m RNA表达(P<0.01),降低α-SMA免疫组化的阳性表达面积(P<0.01),改善肝组织病理学结构病变。与CBRP比较,MF-CBRP抗肝纤维化效果轻微减弱。结论 MF-CBRP通过减轻氧化胁迫、抑制胶原纤维增生、逆转肝星状细胞激活和抑制肝生长因子表达来抗大鼠肝纤维化,但其抗纤维化活性稍弱于CBRP。