人源化CDR3δ1移植性抗体对PBMC治疗肝癌的影响

目的研究人源化CDR3δ移植性抗体GTM-Fc对PBMC治疗肝癌的影响。方法裸鼠皮下注射Hep G2.2.15肝癌细胞,建立移植瘤模型,将荷瘤裸鼠分成PBS组、PBMC和PBMC+Ab 3组,每组9只,PBS组瘤内注射100μL PBS/只,PBMC组注射1×106PBMC/100μL/只,PBMC+Ab组注射3μg GTM-Fc/1×106PBMC/100μL。每3天给药1次并测体质量和肿瘤大小,给药5次后的第3天处死裸鼠。流式细胞仪检测GTM-Fc与肝癌细胞系的结合能力,抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)检测GTM-Fc对PBMC杀伤肝癌细胞系的影响。结果人源化CDRδ1移植性抗体GTM-Fc与肝癌细胞系有良好的结合能力。体外实验证明,它能够促进PBMC对肝癌细胞系的杀伤作用。结论人源化CDR3δ移植性抗体GTM-Fc能够促进PBMC对肝癌的杀伤作用,为研究免疫治疗肝癌提供了新的线索。

rhC5a诱导PBMC产生IL-8与PKC的关系

目的:研究PKC在rhC5a诱导外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-8中的作用。方法:将PBMC分别与rhC5a、PMA、Cheleythrine、 Calphostin C、Dequalinium孵育24 h,取上清用法测定IL-8。将PBMC分别与rhC5a、PMA孵育,按一定时间间隔收集细胞测定 PKC活性。用 Cheleythrine、Calphostin C、Dequalinium预处理 PBMC,然后再以rhC5a诱导测定其 PKC活性。结果:PBMC经rhC5a诱导后IL-8产生水平增加,同时PKC活性呈双峰型增高;PBMC经PMA诱导后不仅PKC活性增高,而且IL-8产生水平也增加;Cheleythrine、Calphostin C、Dequalinium能抑制rhC5a介导的PBMC PKC活性和IL-8产生水平增高。结论:PKC参与rhC5a诱导PBMC产生IL-8细胞内信号转导过程。

CD36抗体引起的胎儿新生儿同种免疫性血小板减少症中人脐静脉内皮细胞通透性作用机理的初步研究

目的探索CD36抗体导致胎儿新生儿同种免疫性血小板减少症(fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia,FNAIT)出现胎儿水肿的发病机制,为临床预防和治疗提供参考。方法利用已经建立的CD36单克隆抗体,与人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells,PBMC)进行孵育,用ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子(TNF-α和IL-1β)的浓度。用富细胞因子的细胞上清与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共同孵育,通过检测FITC-albumin的荧光强度,研究内皮细胞通透性的变化。结果经流式细胞术检测发现,CD36单克隆抗体可以与人的单核细胞结合。与同型对照抗体相比,CD36单克隆抗体与人的PBMC孵育后,细胞培养上清中检测到细胞因子TNF-α(pg/mL)(407.73±20.40 vs 29.38±4.72,P<0.05)和IL-1β(pg/mL)(247.14±83.59 vs 53.68±26.96,P<0.05)浓度升高。检测HUVEC培养transwell下室中的FITC-albumin荧光强度发现,CD36单克隆抗体与人PBMC孵育后的富细胞因子的细胞培养上清可以显著增加内皮细胞的通透性(CD36抗体vs同型对照抗体MFI值:492±16 vs 320±11,P<0.05)。结论CD36单克隆抗体与PBMC作用可导致HUVEC通透性增加,这可能是FNAIT胎儿水肿的发病机制之一。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1表达的抑制作用

目的: 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)对人外周血单个核细胞 (PBMC)中TAP- 1表达的影响。方法: 采用流式细胞仪(FCM)和半定量RT- PCR方法, 从蛋白和mRNA水平上分析不同浓度的DON对体外培养的人PBMC中TAP- 1分子表达的影响及量 效关系。结果: FCM定量检测表明, 用不同浓度的DON处理, 均可一定程度地抑制人PBMC中TAP -1蛋白的表达, 且二者呈显著的负相关 (r= -0. 865,P<0. 01)。半定量RT -PCR检测显示, 不同浓度的DON处理均可抑制人PBMC中TAP -1mRNA的表达。结论: DON可剂量依赖地抑制体外培养的人PBMC中TAP- 1蛋白和其mRNA的表达, 对阐明食管癌高发区被DON污染的粮食与食管癌发生的关系具有重要的意义。

新型CpG ODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法:CpGBW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFNα-含量。将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量。结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFNα-为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低。结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFNα-等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制。

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

冠心病患者单核细胞凝血/纤溶活性改变与中医证型关系

目的 :研究冠心病患者单核细胞凝血 纤溶活性改变与中医辨证分型的关系。方法 :80例冠心病患者分为血瘀证组 30例 ,痰浊证组 2 7例 ,气滞证组 2 3例 ,另设健康对照组 2 0例 ;采用发色底物法分别检测外周血单核细胞 (PBMC)促凝活性 (PCA)、组织型纤溶酶原激活物 (t PA)及其抑制物 (PAI 1)活性。结果 :冠心病各组与健康对照组比较 ,PBMCPCA、PAI 1表达均显著升高 ,而t PA表达显著下降 (P <0 0 1) ;血瘀证与非血瘀证组 (痰浊与气滞组 )之间PBMCt PA、PCA表达有显著差异 (P <0 0 1) ,而PAI 1表达无差异 (P >0 0 5) ;痰浊证组与气滞证组之间各项指标未见差异 (P >0 0 5)。结论 :冠心病患者单核细胞凝血 纤溶活性改变与中医辨证分型之间有一定的相关性 ,PBMCPCA增高和t PA降低的程度对区别血瘀证和非血瘀证具有意义 ,血瘀证患者处于明显的血栓前状态。

冠心病血瘀证单核细胞凝血与纤溶活性研究

采用发色底物法检测冠心病血瘀证和非血瘀证患者外周血单核细胞 (PBMC) 促凝活性(PCA) ,组织型纤溶酶原激活物 (t- PA) 及其抑制物 (PAI- 1) 活性 ,研究冠心病血瘀证患者外周血单核细胞凝血 /纤溶活性改变及其在发病中的意义。 80例冠心病患者作为病例组 ,其中血瘀证组 3 0例 ,非血瘀证组 50例 (包括痰浊证 2 7例 ,气滞证 2 3例 ) ,健康对照组 2 0例。结果表明 ,冠心病血瘀证患者 PBMC PCA显著高于非血瘀证组和正常对照组 (P<0 .0 1) ;但血瘀证和非血瘀证患者 PBMC的 PAI-1活性无显著差异 (P>0 .0 5 ) ,均高于正常对照组 (P<0 .0 1) ;血瘀证患者 PBMC的 t-PA活性显著低于非血瘀证组 (P<0 .0 1) 。故得出冠心病血瘀证患者单核细胞促凝活性增高 ,纤溶活性下降 ,上述凝血 /纤溶改变可能是血瘀证形成的重要因素之一 。

比较人AB型血清与胎牛血清在结核杆菌裂解物刺激人外周血单个核细胞中的作用

目的观察添加人AB型血清或胎牛血清(FBS)培养基培养的人外周血单个核细胞(PBMC)在结核杆菌(M.tb)全菌裂解物(WCL)的刺激下增殖差异。方法健康成人PBMC 1×109·L-1,分别加入WCL 20 mg·L-1,或者同时给予人重组白细胞介素-2(rh IL-2)50 U·m L-1,植物血凝素(PHA)5 mg·L-1,同时设置空白对照组。分别在含10%人AB型血清的RPMI1640培养液和10%FBS的RPMIl640培养液中培养6 d后,用倒置显微镜观察培养结果,运用流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况。结果添加人AB型血清培养基培养条件下,M.tb WCL对淋巴细胞增殖效果较同样条件下添加FBS培养的增殖效果明显,差异有统计学意义(P<0.05)。在WCL和rh IL-2混合组中同样是添加人AB型血清培养增殖效果明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论当以M.tb WCL为抗原的刺激人PBMC时,淋巴细胞在添加人AB型血清培养液中比在添加FBS的培养液中增殖效果更加明显。

一种以病毒作为刺激剂的抑制性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立

目的:研究人工合成的寡聚脱氧核苷酸(ODN)对人体抗病毒免疫反应的抑制作用,为开发具有免疫调节功能的新型ODN提供筛选平台。方法:将热灭活的人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和流感病毒PR8株(PR8-Flu)作为刺激物,同时以已知的免疫抑制性ODNIRS954作为抑制物,用生物学检测方法分析病毒与ODN共同作用的人外周血单个核细胞(PBMC)培养上清的抗病毒活性,并优化各项实验条件。结果:IRS954能显著抑制HSV-1和PR8-Flu诱导的人PBMC的抗病毒活性。在该实验条件下,自行设计的ODN显示出不同的免疫抑制活性。结论:具有一定序列特点的ODN能够抑制由DNA或RNA病毒诱导的人体抗病毒免疫,该实验方法为研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

人O型外周血淋巴细胞制备人单克隆抗-A细胞株

目的以正常O型人外周血淋巴细胞为实验对象,制备能稳定分泌人单克隆抗-A或抗-B的杂交瘤细胞株,在本实验室建立人血型单克隆抗体制备流程。方法使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs),从狨猴B95-8细胞培养上清收获EB病毒(Epstein-Barr virus),用于转化B淋巴细胞,血清学微量板法筛选能够分泌目标抗体的细胞孔。显微镜下挑选分离单个克隆的细胞团,分泌特异性抗体的转化细胞与SHM-D33瘤细胞进行融合,经HOTD选择性培养,血清学筛选,得到分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。结果从随机O型个体的外周血淋巴细胞,成功构建持续稳定分泌人源IgM单克隆抗-A的细胞株。结论本研究提供一种可行的技术路线,为从人外周血淋巴细胞制备有诊断和筛选价值的人源血型单克隆抗体细胞株奠定基础。

人肝再生增强因子对IL-10分泌的影响

目的观察人肝再生增强因子对IL-10分泌的影响。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常组、hALR组、ConA刺激组和ConA+hALR组。培养16h后,用MTT法观察细胞增殖情况,双抗夹心酶联法检测上清中细胞因子IL-2,IL-10水平。结果 ALR显著抑制ConA对细胞的增殖作用的同时,明显促进细胞因子IL-10分泌和显著抑制细胞因子IL-2分泌。结论 ALR可能通过分泌IL-10和抑制IL-2分泌而发挥免疫抑制作用。

肝衰竭患者外周血单个核细胞hTERT mRNA水平及其与临床预后的关系

目的探讨肝衰竭患者外周血单个核细胞(PBMCs)中人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化对预后的评估价值。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测20例正常人和60例肝衰竭患者28天内PBMCshTERT mRNA水平。结果 39例生存患者PBMCs hTERT mRNA水平在入院后依次上调,在入院时、入院后7天、14天、21天和28天分别较正常人升高了2.87、4.27、9.23、23.35和30.50倍,而死亡患者在各时间点依次下降,分别是正常人的3.01、2.08、1.21、0.28和0.06倍;PBMC hTERT mRNA水平对判断预后的ROC曲线下面积在入院时及治疗后7天、14天、21天和28天分别为0.611±0.075、0.676±0.074、0.786±0.065、0.993±0.008和0.998±0.003。结论 PBMCs hTERT mRNA水平可作为肝衰竭患者的预后判断指标,特别是在治疗14天以后。

Ag85B表位多肽对体外单核细胞增殖影响的研究

目的通过观察Ag85B不同表位多肽对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响,筛选出增殖活性较强的Ag85B表位多肽,为制备结核新疫苗提供理论基础。方法采用的实验方法为人工预测Ag85B的表位,并合成多肽。将不同表位多肽体外刺激人外周血单个核细胞,利用CCK-8法测定单核细胞同一时相的吸光值,计算各自的增殖指数,并与BCG、Ag85B抗原等作对比。结果①Ag85B表位多肽组的OD450值及增殖指数均高于阴性对照组,且高于传统抗原BCG;②5条多肽中,28aa多肽的OD450值及增殖指数最高,且显著高于BCG(POD450=0.001<0.01,P增殖指数=0.013<0.05),但低于PHA;③28aa多肽的OD450值及增殖指数明显低于Ag85B,差异有统计学意义(POD450=P增殖指数=0.000<0.01)。结论预测的Ag85B表位多肽抗原具有一定的免疫原性,其中28aa多肽可作为优势表位多肽,但是否可用于表位多肽疫苗候选抗原还需进一步研究。

新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的序列设计和筛选分析

目的:探讨免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)设计原则和筛选方法,为研究和开发新型免疫调节性ODN提供参考。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(hPBMC)作为研究对象,以3H-TdR掺入法检测CpG ODN诱导的细胞增殖水平,对自行设计的ODN的免疫调节活性进行筛选分析。结果:通过对两批免疫调节性ODN的设计和筛选,得到具有较强免疫抑制活性的ODN 667B,与CpG BW006组相比,其抑制率达到66.3%(P<0.01),并具有浓度相关性。结论:总结出免疫调节性ODN的设计原则,同时证明筛选方法可以用于免疫调节性ODN的筛选,为进一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

重型乙型肝炎患者外周血细胞促凝血活性及新型促凝血因子hfgl2的表达

目的:了解各种临床类型乙型肝炎患者外周血细胞的促凝血活性(PCA)及新型促凝血因子人纤维介素(human fibrinogen like protein 2,hfgl2)的表达情况,及其与疾病进展的关系。方法:病毒性乙型肝炎慢性重型25例,健康对照25例,分离外周血单个核细胞(PBMC);病毒性乙型肝炎慢性重度和重型患者标本33例,病毒性乙型肝炎慢性轻度、中度共25例,健康对照25例分离其外周血白细胞(WBC)。用一期冻融法测量其PCA。采用免疫组化的方法检测hfgl2的表达。结果:病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC的PCA较健康对照高出20倍。WBC的PCA在以下各组(健康对照组、病毒性乙型肝炎慢性轻中度组、病毒性乙型肝炎慢性重度和重型组)呈逐步上升过程,但组间差异无显著性意义。PCA在病毒性乙型肝炎慢性重型组患者PBMC中的表达显著高于其在WBC的表达。PCA在健康对照组PBMC和WBC的表达无显著差异,hfgl2在病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC中的表达水平显著高于其在健康对照组中的表达。结论:病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC中的PCA和hfgl2表达均显著升高,且其表达与疾病严重程度相关,hfgl2表达的强度(阳性细胞数)与PCA的升高呈正比相关。

胰腺癌免疫系统人源化小鼠模型的构建及评估

目的构建并评估胰腺癌免疫系统人源化小鼠模型,以期为胰腺癌的免疫治疗研究提供理想的临床前模型。方法应用Ficoll密度梯度离心法,从健康人外周血中分离出新鲜的单个核细胞(peripheral blood mononucear cells,PBMC),经尾静脉注射植入重度联合免疫缺陷小鼠NCG体内,以构建免疫系统人源化小鼠模型,随后在小鼠皮下植入人胰腺癌细胞系Aspc1,并定期监测肿瘤生长情况,在PBMC植入后第3周,应用断尾法采集小鼠外周血进行流式分析,检测人CD45;细胞的水平,当肿瘤生长至100~200 mm;时开始给予抗PD-1单抗治疗,持续治疗3周后,对小鼠施行安乐死并取材,应用流式细胞术、免疫组化等方法分析胰腺癌免疫系统人源化小鼠外周血、脾、骨髓及肿瘤组织中人免疫细胞的浸润及活化情况。结果植入人PBMC 3周后,在小鼠外周血、脾及骨髓中可检测到较高水平的人CD45;细胞;重建的人源免疫系统能够显著抑制人胰腺癌肿瘤的生长(P<0.01,P<0.001),并被人抗PD-1单抗活化,促进肿瘤组织中细胞毒性CD8;T细胞浸润和PD-L1表达。结论成功构建胰腺癌免疫系统人源化小鼠模型,其免疫系统能够对人抗PD-1单抗作出反应,抑制肿瘤生长,可作为一种理想的临床前动物模型用于胰腺癌免疫治疗研究。

补气活血方药对冠心病血瘀证单核细胞凝血、纤溶活性作用研究

目的 :比较补气活血方药对冠心病血瘀证患者单细胞凝血、纤溶活性的作用 ,探讨治疗冠心病的有效方法。方法 :冠心病血瘀证患者30例 ,采用发色底物法分别检测细菌脂多糖(LPS)刺激前后和加用参麦注射液、川芎嗪注射液干预后外周血单核细胞(PBMC)促凝活性(PCA)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI 1)活性 ,比较其变化。结果 :应用LPS刺激后PBMCPAI 1升高 ,PCA升高显著(P<0 01) ,t PA无变化(P>0 05) ;参麦针干预后 ,各项指标均未见改变(P>0 05) ,川芎嗪针能降低PBMCPCA表达(P<0 05) ,而对PA系统表达无影响(P>0 05) ;同时应用川芎嗪加参麦针干预则可降低PBMCPAI 1表达(P<0 05) ,显著降低PCA表达。结论 :活血药降低凝血活性的作用强于补气药 ,补气活血药同时应用明显优于单纯补气药或单纯活血药 ,补气活血标本兼治的方法是治疗冠心病血瘀证患者的有效方法。

人肝癌微血管内皮细胞黏附分子表达特点及其对外周血单个核细胞黏附和跨内皮迁移的影响

目的:研究人肝癌微血管内皮细胞(human liver cancer microvascular endothelial cell,HLCMVEC)上黏附分子表达的特点及其对免疫细胞黏附和迁移的影响。方法:分离培养HLCMVEC,以人肝窦内皮细胞系(liver sinusoid endothelial cell,LSEC)作为正常对照。通过细胞ELISA方法比较多种黏附分子在两种内皮细胞上的表达。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)用荧光染料BCECF标记,将其与HLCMVEC或LSEC共培养,随后采用倒置荧光显微镜和连续光谱荧光仪检测PBMC在两种内皮细胞上的黏附和跨内皮迁移能力;此外,共培养前分别预加各种黏附分子的功能抗体,然后分析各种黏附分子在PBMC与肿瘤微血管内皮细胞黏附和迁移中的作用。结果:HLCMVEC表达CD31、CD34和细胞间黏附分子-3(intercellular adhesion molecule-3,ICAM-3)的水平低于LSEC(P<0.05),表达ICAM-1和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的水平明显低于正常LSEC(P<0.01),但表达整合素αvβ3和αvβ5明显高于LSEC(P<0.01)。PBMC在HLCMVEC上的黏附和趋化剂诱导下的跨内皮迁移均显著低于LSEC[黏附:(205.5±46.0)vs(330.5±48.4)个,迁移:(49.0±10.6)vs(110.0±19.2)个,均P<0.01];该黏附和迁移可被ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1抗体明显阻断(P<0.01),抗CD31抗体对黏附阻断不明显但能阻断跨内皮迁移(P<0.05)。结论:HLCMVEC特有的黏附分子表达特点抑制了PBMC的黏附和跨内皮迁移。

灵芝的生物活性组分及其抑制人体外周血淋巴细胞繁殖的研究(英文)

传统药用灵芝主要是用来医治肝病,肾炎,高血压,高血脂,关节炎,神经衰落,失眠,支气管炎,哮喘,胃溃疡,动脉硬化和糖尿病等。另外,灵芝的一些组分还有一些新发现的功效,如对肝细胞瘤的细胞毒害作用,抑制血小板的凝聚作用,消除紧张,降低胆固醇,阻止组胺的释放和抗艾滋病毒等。尽管在这种真菌中发现了很多中活性物质,如多糖、蛋白质、矿物质和甾醇等,但三萜系化合物是主要的活性成分。在过去的30年中发现120多种三萜系化合物,有必要对这些物质的活性及其结果作出总结。根据羊毛甾烷类三萜系化合物的结构和它们已知的生物学和药学功效可以分为10个类型,本文就此做了一些阐述。有关灵芝促进人体免疫能力的报道还不多。为了阐明灵芝的免疫抑制力的机制,自子实体中的萃取的甲醇抽取物可以分成6个组分,并把它们逐个加到人体血液外围单核细胞(PBMCs)中,发现在无粘附性细胞中,它们可以在细胞繁殖和生长时捕获细胞,但在粘附性的细胞上活性较差,用氯仿萃取物的活性更强,这种活性物质进一步硅胶柱纯化后,可分为7个亚组分。它们当中,GLE1,具有最高的迁移值(Rf值),在一定浓度下可以抑制细胞繁殖,该组分也可以抑制人体异源的淋巴细胞培养物(MLS)。用ELISA检测培养液上清液中分泌的白细胞素-2(IL-2)。